果实成熟相关基因原位瞬时表达方法技术

本发明专利技术公开了一种果实成熟相关基因原位瞬时表达方法，其采用无针注射器，利用其高压射流原理，将含相应表达载体的农杆菌菌液形成较细的液体，瞬间投送入果实的目标组织区域，然后将果实在相应的温湿度条件下培养，使相关表达载体上的目的基因在目标组织区域原位表达而发挥其功能。后期可以通过自然成熟或乙烯催熟等手段来观察相关目的基因对果实成熟特性的影响，也可通过测定注射区域成熟特性、营养品质参数及相关基因表达来分析其对成熟的影响。此法还可以进一步拓展应用于蛋白质相互作用的研究中，如用COIP方法内源验证相关蛋白的互作。该果实成熟相关基因原位瞬时表达方法设计合理，操作简单，能快速对香蕉等果实成熟相关基因进行内源验证。

【技术实现步骤摘要】
果实成熟相关基因原位瞬时表达方法
本专利技术涉及基因工程
，尤其是涉及一种果实成熟相关基因原位瞬时表达方法。
技术介绍
水果一般生长周期长，因而希望像模式植物一样用传统遗传转化的方法来验证相关基因的功能的周期非常长，而且有的水果到目前都还没有建立相应的遗传转化体系。此外，相对其它在苗期可以分析相关表型的基因功能分析，果实成熟相关基因功能分析周期更长。因此，采用瞬时表达的方法来验证成熟相关基因的功能在水果中显得尤为重要。目前在模式植物叶片中已建立较为成熟的瞬时表达方法，但在果实上进行原位瞬时表达的方法还不多见，在番茄中有尝试用传统的含针头的医用注射器手工强行地将含相应表达载体的菌液注射进果肉组织来研究相关基因功能的范例。然而，由于香蕉、苹果、梨等果肉组织致密，传统方法很难将菌液均匀地注射进果肉组织内，经常出现菌液四散喷满全身的情况，操作上有一定的难度，需要多次大量注射，然后从中挑选注射较好的来进行相关的实验研究。这样很难对每次的菌液进行定量，重复性不强，且效果一般。在香蕉中，有人将香蕉果实切片后浸泡于含相应表达载体的菌液中，结合超声和抽真空的处理来帮助细菌侵染果肉组织，然后将果肉组织置于相关的培养基中培养，以此来瞬时表达相关基因。在香蕉上用浸泡的方法，过程非常繁琐，且需要切成小片，不属于原位瞬时表达，且一般只用于研究相关的基因能否在果肉组织中表达，无法以此方法来验证成熟相关基因对成熟特性的影响。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种可以定量且重复性强的果实成熟相关基因原位瞬时表达方法。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下。一种果实成熟相关基因原位瞬时表达方法，包括如下步骤：将含有目的基因表达载体的转化用细菌菌液装入无针注射器内；采用无针注入的方式将所述菌液注入待研究果实的目标组织区域，在所述目标组织区域原位瞬时表达所述目的基因。在其中一个实施例中，所述目的基因通过如下方式获取：将果实或后熟果实的RNA通过逆转录的方式合成cDNA，即得。在其中一个实施例中，所述表达载体上还含有报告基因。在其中一个实施例中，所述转化用细菌为农杆菌。在其中一个实施例中，所述菌液使用的培养基为渗透培养基，其成分是：10mMMgSO4·7H2O、9mMpH为5.6的MES以及100μM乙酰丁香酮(acetosyringone)。在其中一个实施例中，所述待研究果实是但不限于香蕉、苹果、梨或桃。在其中一个实施例中，所述待研究果实是青熟香蕉。在其中一个实施例中，每个待研究果实上选择多个所述目标组织区域，各所述目标组织区域各自独立地注入所述菌液。在其中一个实施例中，所述果实成熟相关基因原位瞬时表达方法还包括在将所述菌液注入待研究果实的目标组织区域后，封住相应的注射位置的步骤。在其中一个实施例中，所述果实成熟相关基因原位瞬时表达方法还包括：在将所述菌液注入待研究果实的目标组织区域后，采用自然成熟或催熟剂催熟的方式使所述待研究果实成熟，以研究所述目的基因对所述待研究果实成熟特性的影响。在其中一个实施例中，在将所述菌液注入待研究果实的目标组织区域时，所述菌液的单次注入量可达300μl。本专利技术的果实成熟相关基因原位瞬时表达方法采用无针注射器，利用其高压射流原理，将含相应表达载体的农杆菌菌液形成较细的液体，瞬间投送入果实的目标组织区域，每次可以投送300μl的菌液，然后将果实在相应的温湿度条件下培养，使相关表达载体上的目的基因在目标组织区域原位表达而发挥其功能。后期可以通过自然成熟或乙烯催熟等手段来观察相关目的基因对果实成熟特性的影响，也可通过测定注射区域成熟特性(如颜色、硬度)、营养品质参数及相关基因表达来分析其对成熟的影响。本专利技术的果实成熟相关基因原位瞬时表达方法可以快速高效且均匀地将转化用细菌菌液投送至果实的目标组织区域，配合相关的渗透培养基，这样更有利于细菌侵染目标组织区域表达相应的目的基因，以达到快速的鉴定相关目的基因对于果实成熟影响的目的。本专利技术的果实成熟相关基因原位瞬时表达方法在注射后的果实基本无痕，可以继续进行相关的处理如乙烯诱导成熟，以此来验证相关的目的基因对后熟过程的影响。此外，此法可以进一步的拓展应用于蛋白质相互作用的研究中，如用免疫共沉淀(COIP)方法内源验证相关蛋白的互作。本专利技术的果实成熟相关基因原位瞬时表达方法设计合理，操作简单，能快速对香蕉果实成熟相关基因进行内源验证，并可以进一步应用至其他水果如苹果、梨、桃等，为成熟相关目的基因功能的验证提供了快速简便的方法。附图说明图1为GUS报告载体投送后染色结果。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将参照相关附图对本专利技术进行更全面的描述。附图中给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本专利技术提供了一种果实成熟相关基因原位瞬时表达方法，其包括如下步骤：步骤一：将含有目的基因表达载体的转化用细菌菌液装入无针注射器内；步骤二：采用无针注入的方式将菌液注入待研究果实的目标组织区域，在目标组织区域原位瞬时表达目的基因。目的基因可以通过但不限于如下方式获取：将果实或后熟果实的RNA通过逆转录的方式合成cDNA，即得。表达载体上还含有报告基因，如抗生素报告基因、荧光染色报告基因等，如在一个具体的示例中，表达载体可以是含有GUS(β-葡萄糖苷酸酶)的报告载体。转化用细菌可以是但不限于为农杆菌。在一个具体的示例中，农杆菌为EHA105根癌农杆菌。菌液使用的培养基优选为渗透培养基，其成分是：10mMMgSO4·7H2O、9mMpH为5.6的MES以及100μM乙酰丁香酮(acetosyringone)。本专利技术的果实成熟相关基因原位瞬时表达方法中待研究果实可以是但不限于香蕉、苹果、梨或桃，如在一个具体的示例中，待研究果实是青熟香蕉。优选地，每个待研究果实上选择多个目标组织区域，各目标组织区域各自独立地注入菌液。进一步，果实成熟相关基因原位瞬时表达方法还包括在将菌液注入待研究果实的目标组织区域后，封住相应的注射位置的步骤。更进一步，果实成熟相关基因原位瞬时表达方法还包括在将菌液注入待研究果实的目标组织区域后，采用自然成熟或催熟剂催熟的方式使待研究果实成熟，以研究目的基因对待研究果实成熟特性的影响的步骤。在将菌液注入待研究果实的目标组织区域时，菌液的单次注入量可达300μl，注入快速高效且均匀性高，配合相关的渗透培养基，可以更有利于细菌侵染目标组织区域表达相应的目的基因，以达到快速的鉴定相关目的基因对于果实成熟影响的目的。本专利技术的果实成熟相关基因原位瞬时表达方法在注射后的果实基本无痕，可以继续进行相关的处理如乙烯诱导成熟，以此来验证相关的目的基因对后熟过程的影响。此外，此法可以进一步的拓展应用于蛋白质相互作用的研究中，如用COIP方法内源验证相关蛋白的互作。以下为具体实施例部分。实施例1本实施例采用含有GUS本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种果实成熟相关基因原位瞬时表达方法，其特征在于，包括如下步骤：将含有目的基因表达载体的转化用细菌菌液装入无针注射器内；采用无针注入的方式将所述菌液注入待研究果实的目标组织区域，在所述目标组织区域原位瞬时表达所述目的基因。

【技术特征摘要】
1.一种果实成熟相关基因原位瞬时表达方法，其特征在于，包括如下步骤：将含有目的基因表达载体的转化用细菌菌液装入无针注射器内；采用无针注入的方式将所述菌液注入待研究果实的目标组织区域，在所述目标组织区域原位瞬时表达所述目的基因。2.如权利要求1所述的果实成熟相关基因原位瞬时表达方法，其特征在于，所述目的基因通过如下方式获取：将果实或后熟果实的RNA通过逆转录的方式合成cDNA，即得。3.如权利要求1所述的果实成熟相关基因原位瞬时表达方法，其特征在于，所述表达载体上还含有报告基因。4.如权利要求1所述的果实成熟相关基因原位瞬时表达方法，其特征在于，所述转化用细菌为农杆菌。5.如权利要求1所述的果实成熟相关基因原位瞬时表达方法，其特征在于，所述菌液使用的培养基为渗透培养基，其成分是：10mMMgSO4·7H2O、9mMpH为5.6的MES以及100μM乙酰丁香酮。6.如权利要求1～5中任一项所述的果...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕方铖，李斌，杨乔松，胡春华，盛鸥，邓贵明，易干军，
申请(专利权)人：广东省农业科学院果树研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44