本发明专利技术涉及香蕉果实特异高效表达启动子及其植物表达载体，该启动子长７４８ｂｐ，以其取代植物表达载体ｐＢＩ１２１上的组成型３５Ｓ启动子，构建成为一个新的植物表达载体，命名为ｐＢＳＰ１。用ＧＵＳ基因瞬时表达方法检测了含有该段启动子及ｐＢＩ１２１启动子的启动活性，ＧＵＳ组织染色显示该启动子具有表达组织特异性，即只在果实表达。ＧＵＳ活性测定其启动活性转化的各香蕉果实高出其他器官１００－３００倍，且略高于３５Ｓ启动子。该启动子的获得，为香蕉的转基因及对香蕉果实的分子生物学研究提供了一个有力的工具，特别是为利用香蕉作为生物反应器的研究和开发创造了条件。因此，该启动子的获得，具有重要理论和实践意义。
【技术实现步骤摘要】
专利说明香蕉果实特异高效表达启动子及其植物表达载体 本专利技术涉及香蕉Banlec基因启动子序列的获得和植物表达载体的构建。香蕉(Musa spp.)属芭蕉科(Musaceae)芭蕉属(Musa)。所有的食用香蕉即为芭蕉属的栽培种，是重要的热带、亚热带水果。香蕉肉质甜糯，芳香味美，且营养价值高。除鲜食、煮食外，还可加工成各种各样营养丰富的产品。香蕉是利用转基因方法生产重组药用蛋白和肽，或者是有价值的化合物的理想植物，其作为生物反应器的优点主要有以下几个方面1、它的生长期短，十至十二个月就可收获；2、香蕉是鲜食水果消耗量最大的水果，鲜食性可以保证水果中的基因表达的药用蛋白不至于变性，是发展中国家儿童口服疫苗的理想载体(Richter L，Mason HS，Artzen CJ (1996).Transgenicplants created for oral immunization against diarrheal diseases.J Travel Med352-56.)。3、产业化程度高。目前香蕉的种植和生产已经达到相当规模，从组培种苗的生产、繁殖、到种植、果园管理、果实采后的加工处理和储藏运输，形成了较为成熟的生产和营销体系，一但有了新的品种，将很快实现产业化。正是基于这种目的，近年来有关香蕉采后成熟相关基因克隆和表达研究逐步深入，试图寻找果实特异表达基因及其启动子，进一步发展和完善香蕉作为生物反应器的研究。外源基因能够在植物组织中实现正常乃至高效的表达，一个重要的条件是构建一个能高水平表达异源蛋白质的表达载体，而对一个高效表达的载体而言，启动子则是其最重要元件之一。因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。已发现的特异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。例如，种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。这些特异性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。果实成熟特异性启动子的研究在番茄上进展较大，番茄E8基因的启动子被证明是果实成熟启动子且对乙烯做出反应，Penarrubia(Penarrubia L，Kim R，Giovannoni J，et al.Productionof the sweet protein monellin in transgenic plants.Bio/Technol.1992，10561-564)等用该启动子转移的指导甜蛋白基因在番茄果实成熟中表达，结果获得较高的表达量，且甜蛋白受乙烯诱导而增加。番茄PG基因(BirdC R，Smith C J S，Ray J A et al.The tomato polygalacturonase gene andripening-specific expression in transgenic plants.Plant Mol.Biol.1998，11651-662)和2A11基因亦被证实为果实成熟特异表达，Chengappa等(Chengappa S，Guilleroux M，Phillips W，et al.Transgenic tomato plantswith decreased sucrose synthase are unaltered in starh and sugar accumulationin the fruit，Plant Mol.Biol.1990，40213-221)用2A11基因启动子在番茄果实中特异表达反义蔗糖合成酶基因，证实为果实特异表达。Atkinson(AtkinsonR G，Bolitho K M，Wright M，et al.Apple ACCoxidase and polygalacturonaseripening-specific gene expression and promoter analysis in transgenic tomato.Plant Mol.Biol.1995，28423-435)和Wang(Wang Z Y，MacRac E A，WrightM A，et al.polygalacturonase gene expression in Kiwifruitrelationship to fruitsoftening and ethylene production.Plant Mol.Biol.2000，42，317-328)分别研究了苹果ACC合成酶、PG基因和猕猴桃PG基因的表达，它们均为果实特异表达，分离三个基因的启动子，分别与报告基因GUS构建表达载体且转化番茄，在转基因番茄中GUS表达表明呈现果实成熟特异性。毛自朝等(果实专一性启动子驱动ipt基因在番茄中的表达及其对番茄果实发育的影响。毛自朝，于秋菊等。科学通报，2002，47(6)444-447)用番茄果实专一性启动子2A12驱动ipt基因在番茄中表达，结果表明在果实中专一表达。香蕉的启动子研究获得一些进展，王新立等(香蕉果实成熟相关基因AC01启动子区的克隆及其功能初探.王新力，彭学贤*.生物工程学报，2001，17(4)428-431；香蕉果实特异性ACC合酶基因启动子区的克隆及其功能初探.王新力，彭学贤*.生物工程学报，2001，17(3)293-296.)2001年克隆了香蕉ACC合成酶和氧化酶基因的启动子，通过GUS基因的瞬时表达研究证实为果实特异性，但未见更深入的研究报道。亦未见有果实特异启动子在香蕉转基因中应用的报道。因此，利用转基因香蕉作为生物反应器存在一个重要难题是需要使用组织特异性启动子，尤其是在果实中特异高效表达的启动子。香蕉凝集素(Banana lectin，BanLec)是在成熟香蕉果实中的一种主要蛋白，我们采用竞争性PCR的方法，对凝集素基因在香蕉不同器官中的表达进行了定量研究，实验结果表明香蕉凝集素基因只在果肉中表达，而且随着采后成熟过程而表现出发育特异性，在成熟度IV的果肉中，表达量最高，每微克总RNA中包含有68ngBanLec基因的转录本(香蕉成熟相关基因的克隆及表达的定量分析。张德有，硕士论文，2002；Jin Zhi-Qiang，Zhang De-You，XuBi-Yu.Cloning and Developmental and Tissue-Specific Expression of Banana(Musa AAA subgroup)Lectin Gene。Ac本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种香蕉果实特异高效表达启动子，其特征在于具有序列表中〈４００〉１项下的序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐碧玉，金志强，刘歌，刘菊华，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，中国热带农业科学院热带作物生物技术国家重点实验室，
类型：发明
国别省市：66[中国|海南]
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