一种共载siRNA与化疗药物的阳离子脂质-介孔硅复合纳米载体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种共载siRNA与化疗药物的阳离子脂质‑介孔硅复合纳米载体的制备方法，该方法包括以下步骤：使用模板剂法合成介孔硅纳米粒，合成MDR1‑siRNA；将介孔硅和化疗药物在有机溶剂中混合，清洗并干燥后得到载药介孔硅；将载药介孔硅分散于溶有脂质类材料的氯仿溶液中，蒸干溶剂成膜后加入分散介质，超声至完全分散，过滤除菌，反复挤出调整粒径大小；将siRNA溶解后与脂质体溶液混合、静置即得。该复合载体能增强药物的细胞毒性、诱导细胞凋亡，在抑制MDR的基础上发挥协同抗肿瘤作用。

【技术实现步骤摘要】
一种共载siRNA与化疗药物的阳离子脂质-介孔硅复合纳米载体的制备方法
本专利技术属于化学制药
，涉及一种共载siRNA与化疗药物的阳离子脂质-介孔硅复合纳米载体的制备方法。
技术介绍
尽管近年来肿瘤化疗取得了长足进步，但在大多数恶性肿瘤治疗中仍效果不佳，其中一个重要原因是肿瘤细胞多药耐药性(multidrugresistance，MDR)的产生。MDR普遍存在于各类肿瘤细胞中，是化疗失败的主要原因。因此，抑制或逆转MDR对肿瘤治疗具有重要的理论和临床实际意义。MDR被普遍认为是肿瘤细胞对抗化疗药物毒性损伤的自我保护防御机制，其发生与多种因素有关。针对常见的耐药机制，人们设计了多种逆转MDR的方法，包括化学药物、免疫技术、基因技术等。其中，使用RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术，利用MDR1-siRNA通过特异性抑制MDR1编码的mRNA，使P-gp的表达水平下调，增强肿瘤细胞对药物的敏感性，逆转效率高，可作为肿瘤治疗的新策略。纳米制剂用作抗肿瘤药物传递载体已有深入的研究与开发，近年来一些研究证实，有多种纳米载药系统不但可以增强药物对肿瘤的杀伤作用，还能降低肿瘤耐药性的产生及逆转MDR，同时不显著改变药物的体内处置过程，且可靶向肿瘤组织。因而，利用纳米载体技术克服肿瘤MDR，较其它策略更为可靠易行，具有广阔的开发应用前景。介孔二氧化硅(MSNs)是一种无机纳米粒，其用作化疗药物传递载体有诸多优势，包括理化性质稳定、比表面积大、孔径和粒度均一可控、可修饰性强以及生物相容性良好等，同时，MSNs也可与其它手段合用，如联合能够下调P-gp和诱导凋亡的siRNA，共同作用于耐药细胞，增强克服MDR的效果。制备脂质体包裹MSNs，制成核/壳复合纳米粒(LMSNs)新型传递系统，可获得更优良的载药性能。由于MSNs的支撑，提高了脂质双分子层的物理稳定性，载体进入细胞后脂质膜被溶酶体破坏，MSNs暴露，药物快速释放，从而达到减少胞外泄漏、于胞内集中释放的效果。更重要地，制备表面带有正电荷的阳离子脂质体，以MSNs包载化疗药物，以脂质体包裹载药MSNs，再通过静电作用于表面吸附MDR1-siRNA，可实现化疗与基因治疗的协同作用，有效克服肿瘤的MDR。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出了一种共载siRNA与化疗药物的阳离子脂质-介孔硅复合纳米载体的制备方法，首先设计合成对MDR1基因具有高抑制效率的siRNA序列，构建其表达质粒，以阳离子膜材制备脂质体(cationicliposomes，CLs)，通过静电吸附作用携载MDR1-siRNA；以MSNs包载化疗药物DOX，再以脂质体包裹载药MSNs，即得siRNA/DOX-CLMSNs。该复合载体表面剩余的正电荷可使其与肿瘤细胞结合，载体进入细胞后脂质膜被破坏，siRNA脱落并沉默MDR1基因，使P-gp蛋白的外排作用下降，同时MSNs暴露并释放DOX，从而增强药物的细胞毒性、诱导细胞凋亡，在抑制MDR的基础上发挥协同抗肿瘤作用。其技术方案如下：一种共载siRNA与化疗药物的阳离子脂质-介孔硅复合纳米载体的制备方法，包括以下步骤：(1)使用模板剂法合成介孔硅纳米粒，合成MDR1-siRNA；(2)将介孔硅和化疗药物在有机溶剂中混合，清洗并干燥后得到载药介孔硅；(3)将载药介孔硅分散于溶有脂质类材料的氯仿溶液中，蒸干溶剂成膜后加入分散介质，超声至完全分散，过滤除菌，反复挤出调整粒径大小；(4)将siRNA溶解后与脂质体溶液混合、静置即得。本专利技术中，步骤(1)中，介孔硅的粒径在40-100nm之间，孔径在1.2-6.0nm之间。介孔硅通过以下步骤合成：以表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵为模板剂，正硅酸乙酯为硅源，在碱性条件下反应，再在甲醇-HCl溶液和去离子水中回流，除去表面活性剂，得到介孔硅。本专利技术中，步骤(2)中，化疗药物可为疏水性药物或多肽、蛋白质、核酸类生物大分子。优选的，所述疏水性药物选自阿霉素(DOX)、紫杉醇、伊利替康或顺铂中任一种。本专利技术中，siRNA序列为5′-GATTGCATTTGGAGGACAA-3′。本专利技术中，脂质体由DOTAP、DOPC、胆固醇、DPPG制备得到。本专利技术中，介孔硅和化疗药物的质量比为2∶1-10∶1，介孔硅与脂质膜的质量比为1∶1-1∶2。本专利技术的有益效果为：①可融合MSNs比表面积大、载药量多以及独特的释药特性和脂质体生物相容性好的优势，克服两者的不足；②脂质膜的包覆可防止药物提前泄露，实现集中释药，并降低全身毒副作用。③以MSNs包载化疗药物、以阳离子脂质体负载MDR1-siRNA，复合载体同时载运并传递化学药物与基因药物，④以siRNA下调外排蛋白表达，联合使用脂质体与MSNs增强细胞摄取与药物蓄积性能、抑制肿瘤MDR，提高抗肿瘤化疗效果，在抑制MDR的基础上发挥协同抗肿瘤作用。附图说明图1：透射电镜图，其中，图1A为MSNs，图1B为Liposomes，图1C为CLMSNs，图1D为siRNA-CLMSNs的透射电镜图。图2：各纳米载体的Zeta电位对比图。图3：各载药(DOX)纳米样品的体外释放曲线图，其中，图3A为pH7.4，图3B为pH5。图4：体外抑瘤活性(MTT)结果。图5：不同载体在倒置荧光显微镜下的荧光成像结果。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术的技术方案作进一步详细地说明。本专利技术采用模板法制备具有规则孔道结构的介孔二氧化硅纳米材料，再用阳离子脂质体将其包裹，通过静电作用于表面吸附MDR1-siRNA，构建出能够在肿瘤细胞内集中定位释放药物、并有效抑制MDR、提高抗肿瘤活性的复合纳米载体。实施例1(1)介孔硅纳米颗粒的制备：在三颈瓶中加入磁石转子和1.0gCTAB，再加入100ml去离子水，95℃下搅拌30min。向瓶中加入160μLDEA液，继续搅拌15min。取8mlTEOS，缓慢滴加(滴加1个小时)，滴加完成后，回流3h，离心，弃去上清液。用甲醇-HCl溶液(4∶1)和去离子水交叉洗3次，去除模板剂。在50℃干燥箱中干燥12h，再真空干燥12h。即得平均粒径约为80nm的介孔硅纳米粒(MSNs)。(2)取介孔硅颗粒于10ml离心管内，加适量PBS分散，滴加5mg/ml的阿霉素(DOX)溶液，混合后定容。搅拌24h，离心，用PBS冲洗至冲洗液无颜色时即得载药介孔硅(DOX-MSNs)。(3)分别称取1，2-二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)30mg、胆固醇30mg、(2，3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)60mg、1，2-棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)30mg与圆底烧瓶，溶于8ml氯仿，取10mgMSNs分散于以上氯仿溶液中，超声至完全溶解。将烧瓶安装到旋转蒸发仪上，设置温度60℃度，调好转速，关闭气阀，气压不超过0.03MPa，开始蒸发。待氯仿完全蒸干成膜后，打开气阀，取下烧瓶，加入分散介质，超声至完全分散，过滤除菌，反复挤出调整粒径大小，即得阳离子脂质体包裹的介孔硅纳米粒溶液(CLMSNs)。使用DOX-MSNs重复以上制备过程，得载药阳离子脂质-介孔硅核/壳复合纳米粒(DOX-CLMSNs)。另制备不包载MSNs的阳离子脂质体(cationiclipo本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种共载siRNA与化疗药物的阳离子脂质‑介孔硅复合纳米载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)使用模板剂法合成介孔硅纳米粒，合成MDR1‑siRNA；(2)将介孔硅和化疗药物在有机溶剂中混合，清洗并干燥后得到载药介孔硅；(3)将载药介孔硅分散于溶有脂质类材料的氯仿溶液中，蒸干溶剂成膜后加入分散介质，超声至完全分散，过滤除菌，反复挤出调整粒径大小；(4)将siRNA溶解后与脂质体溶液混合、静置即得。

【技术特征摘要】
1.一种共载siRNA与化疗药物的阳离子脂质-介孔硅复合纳米载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)使用模板剂法合成介孔硅纳米粒，合成MDR1-siRNA；(2)将介孔硅和化疗药物在有机溶剂中混合，清洗并干燥后得到载药介孔硅；(3)将载药介孔硅分散于溶有脂质类材料的氯仿溶液中，蒸干溶剂成膜后加入分散介质，超声至完全分散，过滤除菌，反复挤出调整粒径大小；(4)将siRNA溶解后与脂质体溶液混合、静置即得。2.根据权利要求1所述的共载siRNA与化疗药物的阳离子脂质-介孔硅复合纳米载体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，介孔硅的粒径在40-100nm之间，孔径在1.2-6.0nm之间；介孔硅通过以下步骤合成：以表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵为模板剂，正硅酸乙酯为硅源，在碱性条件下反应，再在甲醇-HCl溶液和去离子水中回流，除去表面活性剂，得到介孔硅。3.根据权利要求1所述的共载siRNA与化疗...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨硕晔，宋世博，韩凯硕，刘艳萍，陈凌志，吴兴旺，王金水，张贝贝，
申请(专利权)人：河南工业大学，
类型：发明
国别省市：河南,41