本发明专利技术涉及沙门菌、李斯特菌、大肠杆菌O157的检测引物及方法。多重PCR检测引物包括5对引物，分别扩增O157的rfbE、fliC、stx1基因，单增李斯特菌的hlyA基因，沙门菌的invA基因，序列详见序列表所示。使用上述检测引物对肠出血性大肠杆菌O157、沙门菌、单增李斯特菌的DNA进行多重PCR检测，设置阳性对照和阴性对照、空白对照，所述PCR扩增条件为94℃变性5min，然后94℃预变性30s，48‑52℃退火45s，72℃延长45s，共扩增循环30‑35个循环，最后72℃延伸5min。本发明专利技术的肠出血性大肠杆菌O157、沙门菌、单增李斯特菌多重PCR检测引物及检测方法具有特异、灵敏的优点，通过一步检测可以实现对肠出血性大肠杆菌O157、沙门菌、单增李斯特菌的精准鉴定。
【技术实现步骤摘要】
沙门菌、李斯特菌、大肠杆菌O157的检测引物及方法
本专利技术涉及微生物分子生物学检测技术，特别是涉及肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌O157的多重PCR检测引物及方法。
技术介绍
肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌O157属于WHO认定的四大食源性致病菌之列，公共卫生和食品安全意义重大。肠出血性大肠杆菌O157是一种对人致病的大肠杆菌，以引起肠道出血为特点，症状包括腹痛、血性腹泻、败血症、严重胃肠炎等，严重者可并发溶血性尿毒综合症，引起急性肾衰竭、溶血性贫血和血小板减少甚至死亡。潜伏期为1-10日，通常为48-72小时。O157还是重要的人畜共患性和食源性致病菌。O157主要寄生在牛、羊等家畜和其它反刍动物体内。人主要通过食用被人畜粪便污染的食物，如烹煮不彻底的肉馅制品或未经消毒的牛奶、受粪便污染的水和蔬菜等被感染。美国CDC调查表明，每年约有70000人感染肠出血性大肠杆菌病例。O157：H7主要见于婴幼儿，以爆发流行性为主，美国在1982、1984、1993年曾三次发生O157:H7的爆发性流行。日本曾在1996年爆发过波及9000多人的大流行。O157的主要毒力因子有黏附因子(菌毛、外膜蛋白、紧密素等)、肠毒素(志贺毒素STX、溶血素、Ⅲ型分泌系统)等。单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)是一种重要的人畜共患性致病菌和食源性致病菌。LM感染或通过食用污染LM的食品，能引起人和动物的脑膜炎、败血症、严重胃肠炎及孕妇流产等，死亡率高达30％～70％。常见于老人、孕妇或免疫缺陷的人群。LM在4℃能生长繁殖，因此又被成为“冰箱杀手”。2011年夏秋季美国科罗拉多州Jensen农场的甜瓜污染LM引起李斯特菌病的流行，造成146人发病，其中30例死亡。沙门菌(Salmonella)是一种革兰氏阴性菌，菌体呈两端钝圆杆状结构，无芽孢结构，多数的沙门菌有菌毛结构，能够运动。人们对沙门菌普遍易感，沙门菌能够引起急性传染病，常在温度较高时的夏秋季节在整个家庭或者用膳团体但闻爆发性流行。多表现为恶心、呕吐、腹痛、腹泻及发热等临床征候群。沙门菌常常通过食物进行传播。大自然界中沙门菌常寄生于家禽家畜的肠腔内，所以屠宰、加工过程中肉类有可能感染该菌。沙门菌的致病性来自染色体上的毒力基因，少量的基因存在于质粒上。目前对毒力岛的研究主要是研究SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4和SPI-5这五个毒力岛，其中的SPI-2是沙门菌起致病作用的主要原因，其中包含invA、hut、fim、spv、hns等基因是主要的致病毒力因子。这些基因具有高特异性，常用来设计引物用于沙门菌的检测和鉴定。对细菌鉴定方法有微生物分离培养法、形态观察法、生化反应、免疫学方法、分子生物学方法等。传统的微生物分离培养要经过增菌培养、选择培养、鉴别培养等步骤，操作繁琐，耗时长，一般需要5-15天的培养鉴定时间，不能满足食源性微生物快速检测的需求。生化特性鉴定法和血清学鉴定法是基于表型特征进行鉴定的，但这些方法鉴定能力有限，区分度差，常因表型发生变异而导致鉴定失败，因此依据表型特征往往不能准确鉴定微生物，尤其是对血清型众多的大肠杆菌。如已发现山梨醇发酵阳性和β-葡糖醛酸糖苷酶活性阳性的大肠杆菌O157菌株，沙门菌的N群、小肠结肠炎耶尔森氏菌等菌的菌体抗原也能与O157菌体抗原的抗体发生交叉反应，因此，也不能通过生化反应和免疫学方法来鉴定O157菌株。分子生物学检测法是基于核酸检测的方法，具有特异、灵敏等优点，能准确鉴定微生物的种属关系，在微生物的分类鉴定中应用广泛。该类方法又以PCR、多重PCR、荧光定量PCR、基因芯片等检测技术应用较广泛。已公开的检测EHECO157:H7的方法很多，包括PCR、荧光PCR等。这些方法均基于O157的志贺样毒素基因、鞭毛基因fliC、溶血素基因hly和eae基因等之中的一到二种基因而建立的。但许多非O157血清型的EHEC，如O26、O111、O91、O103、O146等血清型的大肠杆菌以及志贺氏菌、霍乱弧菌、枸橼酸杆菌等的部分菌株也具有志贺样毒素基因，因此，单纯使用一对志贺样毒素基因引物检测无法区分O157与EPEC、EHEC的不同血清型。EPEC和EHEC的eae基因有高度的同源性。EHECO26、O111等也有溶血素基因hly，因此对eae、hly基因的鉴定也不能特异检测O157菌株。O157大肠杆菌具有多种鞭毛抗原，而许多非O157血清型菌株，尤其是大肠杆菌O55:H7菌株也有H7鞭毛基因fliC，因此fliC基因检测只能作为辅助检测手段用于大肠杆菌O157:H7菌株的鉴定。到目前为止还没有针对三种毒力基因同时鉴定EHECO157:H7的多重PCR的报道。与现有的O157的PCR检测法比较，本专利技术通过一次扩增O157的stx1、rfbE、fliC三个携带率最高的毒力基因，检测特异性比常规的检测其中一种或二种基因的PCR方法高，可用于O157的精准鉴定，不会发生错检和漏检的情况。本专利技术所述的五重PCR引物及检测方法能够通过一次PCR检测同时鉴定肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌O157三种食源性病原微生物。
技术实现思路
为解决上述
技术介绍
中提到的肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌O157的鉴定耗时长、特异性差、灵敏度低等问题，本专利技术提供了一种同时检测肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌O157三种食源性病原微生物的灵敏度高的多重PCR检测引物及检测方法。本专利技术是通过以下方式实现的：沙门菌、李斯特菌、大肠杆菌O157的检测引物及检测方法，其特征在于包括5对引物，引物序列如下：rfbE上游引物F1：5’-CGTAAGAGGGACCGTAGA-3’(SEQIDNo.1)，rfbE下游引物F2：5’-TGGCTGGATTATCGTTTG-3’(SEQIDNo.2)，fliC上游引物F3：5’-GCTGTCGAGTTCTATCGAG-3’(SEQIDNo.3)，fliC下游引物F4：5’-GTGACTTTATCGCCATTCC-3’(SEQIDNo.4)，stx1上游引物F5：5’-ACGAGGGCTTGATGTCTA-3’(SEQIDNo.5)，stx1下游引物F6：5’-GTAAGGCTTCTGCTGTGA-3’(SEQIDNo.6)，invA上游引物F7：5’-TTTCAATGGGAACTCTGC-3’(SEQIDNo.7)，invA下游引物F8：5’-AACGACGACCCTTCTTTT-3’(SEQIDNo.8)，hlyA上游引物F9：5’-TGATTTGCCAGGTATGAC-3’(SEQIDNo.9)，hlyA下游引物F10：5’-TTTCCCTTCACTGATTGC-3’(SEQIDNo.10)。设计多重PCR引物时应尽量避免引物二聚体、发卡结构的形成。上述引物分别是针对肠出血性大肠杆菌O157的rfbE、fliC、stx1基因、沙门菌的invA基因、单增李斯特菌的hlyA基因的保守区，所以引物能够识别所有的O157的rfbE、fliC、stx基因、沙门菌的invA基因、单增李斯特菌的hlyA基因，因而能检测所有的肠出血性大肠杆本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.沙门菌、李斯特菌、大肠杆菌O157的检测引物及方法，其特征在于包括5对引物，引物序列如下：rfbE上游引物F1：5’‑CGTAAGAGGGACCGTAGA‑3’(SEQ ID No.1)，rfbE下游引物F2：5’‑TGGCTGGATTATCGTTTG‑3’(SEQ ID No.2)，fliC上游引物F3：5’‑GCTGTCGAGTTCTATCGAG‑3’(SEQ ID No.3)，fliC下游引物F4：5’‑GTGACTTTATCGCCATTCC‑3’(SEQ ID No.4)，stx1上游引物F5：5’‑ACGAGGGCTTGATGTCTA‑3’(SEQ ID No.5)，stx1下游引物F6：5’‑GTAAGGCTTCTGCTGTGA‑3’(SEQ ID No.6)，invA上游引物F7：5’‑TTTCAATGGGAACTCTGC‑3’(SEQ ID No.7)，invA下游引物F8：5’‑AACGACGACCCTTCTTTT‑3’(SEQ ID No.8)，hly上游引物F9：5’‑TGATTTGCCAGGTATGAC‑3’(SEQ ID No.9)，hly下游引物F10：5’‑TTTCCCTTCACTGATTGC‑3’(SEQ ID No.10)。...
【技术特征摘要】
1.沙门菌、李斯特菌、大肠杆菌O157的检测引物及方法，其特征在于包括5对引物，引物序列如下：rfbE上游引物F1：5’-CGTAAGAGGGACCGTAGA-3’(SEQIDNo.1)，rfbE下游引物F2：5’-TGGCTGGATTATCGTTTG-3’(SEQIDNo.2)，fliC上游引物F3：5’-GCTGTCGAGTTCTATCGAG-3’(SEQIDNo.3)，fliC下游引物F4：5’-GTGACTTTATCGCCATTCC-3’(SEQIDNo.4)，stx1上游引物F5：5’-ACGAGGGCTTGATGTCTA-3’(SEQIDNo.5)，stx1下游引物F6：5’-GTAAGGCTTCTGCTGTGA-3’(SEQIDNo.6)，invA上游引物F7：5’-TTTCAATGGGAACTCTGC-3’(SEQIDNo.7)，invA下游引物F8：5’-AACGACGACCCTTCTTTT-3’(SEQIDNo.8)，hly上游引物F9：5’-TGATTTGCCAGGTATGAC-3’...
【专利技术属性】
技术研发人员：颜世敢，张文成，朱丽萍，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37
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