两种具有ACE抑制活性的弹涂鱼源活性肽制造技术

本发明专利技术提供了两种具有ACE抑制活性的弹涂鱼源活性肽，其氨基酸序列分别IDF和EGF；本发明专利技术借助体内消化酶模拟体系并以特定靶点为导向，获得ACE抑制三肽序列，该方法具有特征性强，灵敏度高等优点；还涉及这两种肽与血管紧张素转换酶结合并抑制其活性的作用位点。对开发具有抗高血压的海洋资源食品、保健品及药物提供了新方法。

【技术实现步骤摘要】
两种具有ACE抑制活性的弹涂鱼源活性肽
本专利技术属于生物
，主要涉及两种具有ACE抑制活性的弹涂鱼源活性肽。
技术介绍
生物活性肽是特异性的蛋白质片断，通过有效促进机体功能或状态来改善人类的健康。这些生物活性肽在母蛋白中没有活性，但却能通过蛋白水解或发酵释放出来而产生活性。在体内，这些生物活性肽能够发挥多种不同的活性，不仅可改善养分的利用，还可影响心血管、内分泌、免疫以及神经系统。血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽通常是一类具有抑制ACE活性的小肽物质，往往与ACE通过不同方式结合后，抑制了ACE催化无活性的血管紧张素I水解为血管紧张素II的作用，进而起到降低血压的目的。我国海洋资源丰富，种类繁多，海洋生物是新化合物的巨大来源，也是生物活性肽的巨大储存库，开发前景广阔。大弹涂鱼(Boleophthalmuspectinirostris)是系沿岸暖水广温广盐性两栖鱼类。大弹涂鱼具有食物链短，鱼病少，易于养活，耐长途运输等特点，是一种有前途的滩涂养殖鱼类。通过酶解大弹涂鱼蛋白质获得的ACE抑制肽安全性高、毒副作用小、容易吸收，可长期服用，作为降压药物或保健食品有着良好的应用前景。但是基于传统的生物酶解、色谱多维分离及结构鉴定，不仅增加成本而且费时费力，同时会造成一些高活性肽片段的筛选遗漏。因此成为制约鉴定具有ACE抑制活性的肽的高效筛选。本专利技术利用在线酶解方法可以定向的针对ACE抑制肽特异性进行筛选并获得氨基酸序列，节省时间并且提高经济效益，为抗高血压活性肽功能性产品及药物研究提供基础，将海洋蛋白作为制备活性肽的良好来源，在预防疾病、保障人体健康方面发挥重要的作用，进而推动人类对于海洋蛋白资源深加工。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供：一种分离的生物活性三肽IDF，其包括(a)由Ile-Asp-Phe所示的氨基酸组成的三肽；(b)或在Ile-Asp-Phe所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由(a)衍生的多肽；一种分离的生物活性三肽EGF，其包括(c)由Glu-Gly-Phe所示的氨基酸组成的三肽；(d)或在Glu-Gly-Phe所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由(c)衍生的多肽；所述生物活性三肽的来源于弹涂鱼肌动蛋白。所述三肽的衍生物，是指在三肽的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物。本专利技术通过利用生物信息学的方法，借助在线活性肽数据库，通过虚拟酶解弹涂鱼肌动蛋白，并利用活性肽的分子量、生物活性评分、水溶性、ADMET等性质进行多轮筛选，结合分子对接实验得到与ACE稳定结合的两种生物活性肽，并通过高效液相色谱法验证体外ACE抑制活性，其三肽序列为IDF和EGF，IC50值分别为423.00μM和451.21μM。最后利用分子对接软件，阐明IDF和EGF分别与ACE相互作用催化位点的氨基酸残基。本专利技术ACE抑制肽的有益效果为：本专利技术的弹涂鱼源ACE抑制肽具有体外ACE抑制活性；两种ACE抑制肽在通常的动物体内消化条件下稳定，能够通过胃肠道直接吸收利用发挥其具有的生物活性功能；本专利技术获得活性肽序列未经报道，为功能食品开发提供了新的资源。附图说明本专利技术附图2幅，其中：图1ACE与IDF相互作用；图2ACE与EGF相互作用；具体实施方式本专利技术采用的实验步骤，具体如下：实施例1原料的筛选本专利技术从NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/XP_020776504)数据库中搜寻海洋蛋白源相关的蛋白质序列进行分析，选定大弹涂鱼肌动蛋白作为ACE抑制肽的原料蛋白。accession号为XP_020776504，含有6578个氨基酸。实施例2三肽IDF和EGF的筛选在ExPASyPeptideCutter(https：//web.expasy.org/peptide_cutter/)中使用Pepsin(pH1.3)和Trypsin对大弹涂鱼肌动蛋白蛋白(accession：XP_020776504)进行在线水解，水解得到含有不同氨基酸的肽序列，并筛选出所有含有三个氨基酸的肽序列。将这些三肽在PeptideRanker(http：//bioware.ucd.ie/～compass/biowareweb/Server_pages/Peptideranker.php)中进行活性评分，共筛选出17种活性评分高于0.55的三肽。同时，对这17种肽的水溶性Innovagen(http：//www.innovagen.corn/proteomics-tools)和毒性ToxinPred(http：//crdd.osdd.net/raghava//toxinpred/)分别进行预测，筛选出水溶性好且无毒性的三肽。这17种三肽的肽序列、活性评分、水溶性及其毒性预测结果见表1。使用admetSAR(http：//lmmd.ecust.edu.cn/admetsar1/predict/)对上一步筛选出的三肽进行ADMET预测，测定胃肠吸收良好(goodintestinalabsorption，HIA+)的三肽，筛选得到了预测结果为HIA+的三肽，分别为IDF，VWR，EGF和GDL。将四种三肽分别与ACE(PDBID：1O86)进行分子对接作为潜在高效ACE抑制肽候选物。结果表明，有两种活性肽与ACE稳定结合，其CDOCKER值见表2，所选两种活性肽IDF和EGF即为本专利技术鉴定得到的三肽。表1选定三肽的活性评分、水溶性及毒性预测结果表2分子对接中三肽与ACE结合能实施例3体外活性验证ACE抑制肽是经过大弹涂鱼伴肌动蛋白的在线筛选和分子对接而得到，为了验证本专利技术IDF和EGF的ACE抑制活性，采用高效液相色谱法。1、仪器及化学用品：C18液相色谱柱，岛津LC-2030高效液相色谱仪，马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)、马尿酸(HA)、血管紧张素转化酶(ACE)购自Sigma公司，乙腈、甲醇和三氟乙酸(TFA)购自FisherScientific公司。所有试剂均为色谱纯。2、高效液相色谱分析：取HHL底物溶液，加入抑制剂混合均匀，在37℃恒温水浴中预热3～5min，然后加入ACE液充分混合，37℃保温30min后立即进行反应，同时用硼酸缓冲液替代抑制剂溶液作为空白对照组。该反应液直接用HPLC系统进行分析。色谱条件：柱温25℃，流速0.5mL/min，进样量10μL，流动相乙腈∶水为25∶75等度洗脱，检测波长228nm。利用下列公式计算不同浓度三肽的抑制率：ACE抑制活性(％)＝(A-B)/A×100％其中A是反应空白的峰面积，反应空白混合物含有相同体积的缓冲溶液而不是样品；B是ACE和酶促肽样品存在下反应的峰面积，IC50值定义为在测定条件下抑制50％ACE活性的抑制剂浓度。ACE活性的定义：ACE活性的一个单位(U)定义为在37℃下每分钟从催化HHL形成1mol的HA所需的酶量。活性肽对ACE酶活性抑制实验结果显示(见表3)，本专利技术的两种三肽对ACE具有显著的ACE抑制特性。表3三肽对ACE酶抑制活性实施例4活性肽与ACE的虚拟对接分析使用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.两种具有ACE抑制活性的弹涂鱼源活性肽，其特征是，所述活性肽的氨基酸序列分别为IDF和EGF。

【技术特征摘要】
1.两种具有ACE抑制活性的弹涂鱼源活性肽，其特征是，所述活性肽的氨基酸序列分别为IDF和EGF。2.根据利要求1所述的两种具有ACE抑制活性的弹涂鱼源活性肽，其特征是，IDF与ACE(PDBID：1O86)催化位点的氨基酸残基分别为Val518，Tyr520，Tyr523，His...

【专利技术属性】
技术研发人员：于志鹏，樊玥，赵文竹，张馨月，
申请(专利权)人：渤海大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21