Micro-15b在制备诊断糖尿病视网膜病变试剂中的应用制造技术

本发明专利技术涉及Micro‑15b在制备诊断糖尿病视网膜病变试剂中的应用，属于医药技术领域。目前对糖尿病视网膜病变做诊断的手段主要是通过形态学的方法如眼底照相、眼底血管造影等，这些诊断为时已晚，不具备早期预测、早期诊断的作用，可能失去病情最早的治疗时机，延误病情。本发明专利技术为了解决现有技术的这些不足，提供Micro‑15b在制备诊断糖尿病视网膜病变试剂、试剂盒中的应用。该试剂和试剂盒可用于早期预测、早期诊断糖尿病视网膜病变和判断糖尿病视网膜病变治疗效果，可以在糖尿病视网膜功能和形态改变之前就给予干预，及早预防和治疗，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
Micro-15b在制备诊断糖尿病视网膜病变试剂中的应用
本专利技术属于医药
，具体涉及Micro-15b在制备诊断糖尿病视网膜病变试剂中的应用。
技术介绍
micrRNA可以通过使mRNA翻译受阻或者过表达来参与基因转录后水平调控，最终导致靶蛋白低水平异常，从而影响细胞发育、分化、生长、凋亡和新陈代谢等生理及病理过程。而关于micrRNA的研究已发现，micrRNA的异常表达与调控机制和糖尿病视网膜病变的发病之间存在着紧密联系。micrRNA作为一种新型基因表达调控因子，其表达谱犹如网络结构纷繁复杂，虽然不少研究者已经在micrRNA与糖尿病视网膜病变领域的研究中取得一些进展，但仍然处于起步阶段，需要更深入广泛的研究来阐明两者之间的确切关系，随着被发现的micrRNA越来越多，其与糖尿病视网膜病变之间的关系将被越阐越明，也更有利于我们找到属于糖尿病视网膜病变最具特异性的micrRNA。糖尿病视网膜病变是导致糖尿病病人失明的主要因素；糖尿病视网膜病变与视网膜内皮细胞异常血管新生有密切关系；VEGF是导致糖尿病视网膜病变发生和发展的重要病理因素；microRNA亦是导致糖尿病视网膜病变的重要分子机制；针对VEGF表达具有调控作用的microRNA研究将对糖尿病视网膜病变的研究提供重要方向；探究糖尿病视网膜病患者外周循环血中microRNA表达亦是对糖尿病视网膜病变发病机制提供重要基础数据。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，提供Micro-15b在制备诊断糖尿病视网膜病变试剂中的应用。本专利技术采用micrRNA为手段，能够早期预测诊断糖尿病视网膜病变，可以在糖尿病视网膜功能和形态改变之前就给予干预，及早预防和治疗。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术提供Micro-15b在制备诊断糖尿病视网膜病变试剂中的应用。同时，还提供Micro-15b在制备诊断糖尿病视网膜病变试剂盒中的应用。进一步，优选的是，试剂包括采用基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测血浆中Micro-15b转录水平的试剂。进一步，优选的是，所述的样本为外周血。进一步，优选的是，试剂包括采用northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法或原位杂交检测血浆中Micro-15b的转录水平的试剂。进一步，优选的是，所述的样本为外周血。本专利技术还提供一种诊断糖尿病视网膜病变的试剂，包括药学上可接受的载体和有效量的Micro-15b。本专利技术另外提供一种诊断糖尿病视网膜病变的试剂盒，包括Micro-15b。本专利技术与现有技术相比，其有益效果为：目前对糖尿病视网膜病变做诊断的手段主要是通过形态学的方法如眼底照相、眼底血管造影等，这些诊断为时已晚，不具备早期预测、早期诊断的作用，可能失去病情最早的治疗时机，延误病情。本专利技术为了解决现有技术的这些不足，提供Micro-15b在制备诊断糖尿病视网膜病变试剂、试剂盒中的应用。该试剂和试剂盒可用于早期预测、早期诊断糖尿病视网膜病变和判断糖尿病视网膜病变治疗效果；本专利技术采用micrRNA为手段，能够早期预测诊断糖尿病视网膜病变，可以在糖尿病视网膜功能和形态改变之前就给予干预，及早预防和治疗，具有良好的应用前景。附图说明图1为糖尿病视网膜病变患者及正常人群外周血RNA测序分析结果图；其中A为糖尿病视网膜病变患者3例，正常人群3例测序结果进行Cluster分析结果；B为测序结果中差异microRNA表达值取对数2结果(Log2FoldChange)、统计差异分析结果值(P-Value)、与靶基因结合热力学稳定性评分(miRSVRscore)以及microRNA在各物种中进化保守性评分(Phastconsscroe)。图2为miR-15b与靶基因VEGF体外结合检测结果图；其中A为VEGF的野生型(wt)或突变型(mut)的3'-UTR序列区中miR-15b结合序列信息；B为miR-15b作用于VEGF的3’-UTR区域后，相对荧光素酶活性检测(RelatvieLuciferaseActivity)结果，其中miR-15b处理组与NC(阴性对照)处理组相比较，**P<0.01；3’UTR-VEGF(wt)与3’UTR-blank处理组相比较，##P<0.01；3’UTR-VEGF(wt)与3’UTR-VEGF(mut)相比较，@@P<0.01。3’UTR-blank为空载体，3’UTR-VEGF(wt)为野生型VEGF3'-UTR区域，3’UTR-VEGF(mut)为突变型VEGF3'-UTR区域。图3为GK大鼠视网膜免疫组化和免疫荧光铺片图；其中A为GK大鼠眼底注射Let-NC及Let-miR-15b病毒后，原位杂交检测视网膜中miR-15b表达情况；B为GK大鼠眼底注射Let-NC及Let-miR-15b病毒后，视网膜铺片染色检测结果，可发现注射Let-miR-15b后，GK大鼠视网膜中血管病变减少；Let-NC为阴性对照病毒，Let-miR-15b为miR-15b过表达病毒，外核层(ONL)、内核层(INL)、浅层视网膜(IPL)和神经节细胞层(GCL)。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。本专利技术除非另有说明，否则百分数表示质量百分数；比例为质量比。1患者本研究所涉及的患者为2014年1月到2016年1月在云南省第二人民医院内分泌科住院治疗的2型糖尿病患者，共入组238名。所有患者均进行眼底检查(裂隙灯观察)，并记录眼底情况。而针对糖尿病视网膜病变患者还行眼底荧光造影检查。将所有糖尿病患者分为糖尿病无视网膜病变组(NDR)、非增殖性糖尿病视网膜病变组(NPDR)和增殖性糖尿病视网膜病变组(PDR)。其中有风湿病和感染性疾病的患者被排除于本研究。血浆中VEGF水平用酶联免疫法测定(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。本研究经云南省第二人民医院伦理委员会同意，患者在参加本研究之前均已进行告知，并签署知情同意书。2循环血中差异microRNA的测序分析选取NDR组和PDR组各3名患者，分别采用Trizol试剂盒(Invitrogen)提取总RNA。RNA提取质量使用Bioanalyzer2200(Aligent)分析仪检测，RNA纯度测定值：RIN>8.0时证明microRNA纯度过关，microRNA纯化采用miRNeasyMiniKit(Qiagen)试剂盒进行纯化，microRNA纯化结果使用凝胶电泳验证。使用IonTotalRNA-SeqKitv2.0(LifeTechnologies)试剂盒来构建单链测序用cDNA文库，操作步骤依据试剂盒说明书进行。通过PAGE凝胶电泳分析cDNA大小，依据microRNA分子量大小，收集cDNA文库中microRNA片段并进行microRNA测序。microR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.Micro‑15b在制备诊断糖尿病视网膜病变试剂中的应用。

【技术特征摘要】
1.Micro-15b在制备诊断糖尿病视网膜病变试剂中的应用。2.Micro-15b在制备诊断糖尿病视网膜病变试剂盒中的应用。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，试剂包括采用基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测血浆中Micro-15b转录水平的试剂。4.根据权利要求3所述的的应用，其特征在于，所述的样本为外周血。5.根据权利要求1或2所述的应用，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨莹，杨克，周太成，李奕平，陶文玉，吴丽萍，
申请(专利权)人：云南省第二人民医院，上海交通大学医学院附属瑞金医院，
类型：发明
国别省市：云南,53