选择由活性化合物诱导的特定效应的基于RNA编辑的算法和体外方法技术

本发明专利技术涉及用于体外预测药物或化合物在患者中诱导特定效应的概率的算法和使用该算法的方法，所述方法使用表现出RNA的A至I编辑的至少一个靶标。本发明专利技术还涉及实施所述方法的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】选择由活性化合物诱导的特定效应的基于RNA编辑的算法和体外方法本专利技术涉及用于体外预测药物或化合物在患者中诱导特定效应的概率的算法和使用该算法的方法，所述方法使用表现出RNA的A至I编辑的至少一个靶标。本专利技术还涉及实施所述方法的试剂盒。精神病症在全球健康系统中的权重越来越大(1)。其是西方社会的常见病症，且在1/5个体的一生中至少影响其1次。精神科病症由影响大脑回路、神经传递和神经可塑性的分子途径受扰所致。近期研究表明，诸如甲基化、乙酰化和脱氨等DNA和RNA上的表观遗传修饰的改变与例如重度抑郁症、双相情感障碍和精神分裂症相关(2,3)。近期研究还启发了催化RNA上的腺苷脱氨(RNA的A至I编辑)的编辑酶的重要性。已显示该具体机理会直接调节基本上编码高度保守的神经递质和突触相关因子的基因的功能(4-7)。重要的是，该RNA编辑机制和同源ADAD酶(作用于RNA的腺苷脱氨酶)在健康和疾病中的作用近来已通过其在罹患精神科病症的患者的大脑中的失调的累积证据而得到更深入的支持(8,9)。ADAR作用于双链前体mRNA茎环以特异性地使腺苷残基优先脱氨。位于编码序列中的残基的脱氨会导致产生具有不同药理学性质的受体变体(例如，5-羟色胺2c受体、谷氨酸受体)的氨基酸取代(10)。已提出在大脑中的5-羟色胺生物学的异常是潜藏于抑郁和/或自杀行为的特征性状(11-13)。通过分析自杀牺牲者的死后脑组织，专利技术人等已观察到针对已知会极大地损害5-HT2CR药理学性质的5-羟色胺受体2C(5HT2cR)前体mRNA的RNA编辑活性的明显改变(10,14)。令人感兴趣的是，自杀牺牲者的人皮质中的5-HT2cRmRNA编辑谱的这些改变与在SH-SY5Y细胞中观察到的经干扰素诱导的变化部分地重叠。专利技术人精确定位了特定的生物标志物来表征与抑郁/自杀患者相关联的5-HT2cR的“RNA编辑特征”。已报道属于不同治疗类别的几种药物会潜在诱导严重的精神科副作用，尤其是抑郁和自杀倾向(15-18)。今天，尚未有鉴定这类分子的许可测试，而美国食品药品管理局(FDA)仅发出了关于整个治疗类别的一般性警告。因此，存在对提供能以高精度和高区分力确定药物或候选药物诱导负面副作用的风险的体外测试的需求。专利技术人验证了此前设计的利用仔细选出的细胞系(SH-SY5Y)预测药物诱导的精神科副作用的新型体外检测。专利技术人筛选了260种市场许可的化合物以检验药物诱导的5-HT2cR编辑的改变。化合物选自宽范围的已知会(带有FDA警示标签和/或许多病例报告)或不会(没有经报道的精神科副作用)潜在诱导自杀倾向的治疗类别(抗抑郁剂、抗精神病药、抗肥胖剂、抗病毒剂、抗炎剂、抗真菌剂、抗癫痫药、情绪稳定剂等等)。数据被用于以高特异性和灵敏度来鉴定“有风险”的化合物。在第一方面，本专利技术涉及一种用于体外预测化合物、特别是药物在患者中诱导特定效应的概率的算法，其中，所述算法通过包括以下步骤的方法获得：a)-选择展示出RNA的A至I编辑的至少一个靶标，其前体mRNA是ADAR酶(作用于RNA的腺苷脱氨酶)的底物，所述ADAR的作用导致产生不同的亚型或位点，-选择内源性表达所述至少一个靶标和至少所述ADAR酶的至少一个细胞系，-选择阳性对照化合物，在所述细胞系的细胞经所述阳性对照处理时所述阳性对照化合物能够以剂量依赖性方式改变所述靶亚型/或编辑位点的相对比例；-选择由一定比例的注释有诱导所述特定效应的风险评分的化合物的组成的分子集合，b)采用所述分子集合的每一种分子以及阴性对照和所述阳性对照来处理所述细胞系的细胞，c)分析已用所述集合的分子处理的每个样品中的所述至少一个靶标RNA编辑谱，从而获得针对所述集合的每种分子且针对所述靶标的每种编辑亚型/或位点而言的所述靶标的RNA编辑水平的比例，d)-i)通过单变量分析统计法，针对每种亚型/或编辑位点评估其精度及其区分分子诱导所述特定效应的风险的能力；和/或-ii)通过多变量分析统计法，针对亚型和/或编辑位点的每种组合来评估其精度及其区分分子诱导所述特定效应的风险的能力；和-iii)选择展示出最佳区分性能的组合，e)利用所选择的亚型/或编辑位点的组合来建立算法，和使用由此获得的算法来预测药物、化合物或分子在患者中诱导所述特定效应的概率。本说明书中的化合物意指矿物、化学或生物学化合物，特别是他们能对人、动物患者或者在植物中有活性。在本说明书中，用语“患者”也包括植物。术语“算法”也包括统计模型(例如Cart模型)。在优选实施方式中，在根据本专利技术的所述算法中，所述特定效应是副作用，优选选自负面或希望的副作用、优选负面副作用。在优选实施方式中，展示出RNA的A至I编辑的所述靶标选自由5-HT2cR、PDE8A(磷酸二酯酶8A)、GRIA2(谷氨酸受体2)、GRIA3、GRIA4、GRIK1、GRIK2、GRIN2C、GRM4、GRM6、FLNB(细丝蛋白B)、5-HT2A、GABRA3(GABAα3)、FLNA、CYFIP2组成的组。在优选实施方式中，所述特定效应、优选副作用、更优选希望的或负面的副作用选自包括以下的组：心血管、变态反应学、CNS、特别是精神科、皮肤病学、内分泌学、胃肠病学、血液学、感染学(infectiology)、代谢、神经肌肉、肿瘤学、炎性和肥胖、负面副作用。更优选的是精神科负面副作用。在优选实施方式中，根据本专利技术的算法的所述细胞系的细胞来自内源性表达所述靶标和ADAR的细胞系。更优选地，所述细胞系选自由以下组成的组：-能够内源性表达所述靶标并展示与人皮质中所观察到的相似的ADAR酶表达稳态的人或动物细胞系，-成神经细胞瘤细胞系，优选人细胞系，-成神经细胞瘤细胞系，对其而言在相对于阴性对照或空载剂对照归一化时阳性对照以至少4倍、优选至少5或6倍的倍数诱导来诱导ADAR1a表达，和-人SH-SY5Y细胞系。在优选实施方式中，在步骤b)中，所述细胞系的细胞在12h至72h、优选48h±4h的时段中用待测试的分子或对照进行处理，最优选48h。在优选实施方式中，在根据本专利技术的算法中，所述阳性对照是干扰素α，或能够以100IU/ml再现干扰素RNA编辑谱的化合物(如例如图6中所示)。使用SH-SY5Y人成神经细胞瘤细胞系，这是因为其内源性表达5-HT2cRmRNA并且展示出与人皮质干扰素α中所观察到的类似的ADAR酶表达稳态。在优选实施方式中，在根据本专利技术的算法或模型中，步骤c)包括以下步骤：相对于经空载剂处理的对照细胞，针对所述细胞系中的每种亚型或位点确定RNA编辑的基础水平，从而针对每种分子和每种编辑亚型或编辑位点获得所述靶标的RNA编辑水平的平均/中位数相对比例。优选地，所述经空载剂处理的对照细胞是经DMSO处理的对照细胞。在优选实施方式中，在根据本专利技术的算法或模型中，所述方法是用于体外预测化合物、特别是药物无风险地或者以低风险或高风险(优选无风险或高风险)诱导特定效应(优选副作用，优选地选自负面或希望的副作用，优选负面副作用)的概率的方法。在特定的优选实施方式中，在根据本专利技术的算法或模型中，所述分子集合由平衡比例的分子组成，每种分子注释有诱导所述特定效应(其为副作用，优选地选自负面或希望的副作用，优选负面副作用)的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于体外预测化合物在患者中诱导特定效应的概率的算法，其中，所述算法或模型通过包括以下步骤的方法获得：a)‑选择展示出RNA的A至I编辑的至少一个靶标，其前体mRNA是ADAR酶(作用于RNA的腺苷脱氨酶)的底物，所述ADAR对至少一个编辑位点的作用导致产生不同的亚型或位点，‑选择内源性表达所述至少一个靶标和至少所述ADAR酶的至少一个细胞系，‑选择阳性对照化合物，在所述细胞系的细胞用所述阳性对照化合物处理时，所述阳性对照化合物能够以剂量依赖性方式改变所述靶亚型或编辑位点的相对比例；‑选择由一定比例的注释有诱导所述特定效应的风险评分的化合物组成的分子集合，b)采用所述分子集合的每一种分子以及阴性对照和所述阳性对照来处理所述细胞系的细胞，c)分析已由所述集合的分子处理的每个样品中的所述至少一个靶标RNA编辑谱，从而获得针对所述集合的每种分子且针对所述靶标的每种编辑亚型和/或位点而言的所述靶标的RNA编辑水平的比例，d)‑i)通过单变量分析统计法，针对每种亚型和/或编辑位点评估其精度及其区分分子诱导所述特定效应的风险的能力；和/或‑ii)通过多变量分析统计法，针对亚型和/或编辑位点的每种组合来评估其精度及其区分分子诱导所述特定效应的风险的能力；和‑iii)选择展示出最佳区分性能的组合，e)利用亚型/或编辑位点的所选择的组合来建立算法，和使用由此获得的所述算法来预测所述化合物在患者中诱导所述特定效应的概率。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.11 EP 160006001.一种用于体外预测化合物在患者中诱导特定效应的概率的算法，其中，所述算法或模型通过包括以下步骤的方法获得：a)-选择展示出RNA的A至I编辑的至少一个靶标，其前体mRNA是ADAR酶(作用于RNA的腺苷脱氨酶)的底物，所述ADAR对至少一个编辑位点的作用导致产生不同的亚型或位点，-选择内源性表达所述至少一个靶标和至少所述ADAR酶的至少一个细胞系，-选择阳性对照化合物，在所述细胞系的细胞用所述阳性对照化合物处理时，所述阳性对照化合物能够以剂量依赖性方式改变所述靶亚型或编辑位点的相对比例；-选择由一定比例的注释有诱导所述特定效应的风险评分的化合物组成的分子集合，b)采用所述分子集合的每一种分子以及阴性对照和所述阳性对照来处理所述细胞系的细胞，c)分析已由所述集合的分子处理的每个样品中的所述至少一个靶标RNA编辑谱，从而获得针对所述集合的每种分子且针对所述靶标的每种编辑亚型和/或位点而言的所述靶标的RNA编辑水平的比例，d)-i)通过单变量分析统计法，针对每种亚型和/或编辑位点评估其精度及其区分分子诱导所述特定效应的风险的能力；和/或-ii)通过多变量分析统计法，针对亚型和/或编辑位点的每种组合来评估其精度及其区分分子诱导所述特定效应的风险的能力；和-iii)选择展示出最佳区分性能的组合，e)利用亚型/或编辑位点的所选择的组合来建立算法，和使用由此获得的所述算法来预测所述化合物在患者中诱导所述特定效应的概率。2.如权利要求1所述的算法，其中，所述效应是选自负面或希望的副作用、优选负面副作用的副作用。3.如权利要求1或2所述的算法，其中，展示出RNA的A至I编辑的所述靶标选自由5-HT2cR、PDE8A(磷酸二酯酶8A)、GRIA2(谷氨酸受体2)、GRIA3、GRIA4、GRIK1、GRIK2、GRIN2C、GRM4、GRM6、FLNB(细丝蛋白B)、5-HT2A、GABRA3、FLNA、CYFIP2组成的组。4.如权利要求1至3中任一项所述的算法，其中，所述特定效应是负面精神科副作用。5.如权利要求1至4中任一项所述的算法，其中，所述细胞系内源性表达所述靶标和ADAR，并且选自由以下组成的组：-成神经细胞瘤细胞系，优选人细胞系，-成神经细胞瘤细胞系，对其而言阳性对照诱导的ADAR1a基因表达在相对于阴性对照或空载剂对照归一化时为至少4、5或6倍的倍数诱导，和-人SH-SY5Y细胞系。6.如权利要求1至5中任一项所述的算法，其中，在步骤b)中，所述细胞系的细胞在12h至72h、优选48h±4h的时段中用待测试的分子或对照进行处理。7.如权利要求1至6中任一项所述的算法，其中，所述阳性对照是干扰素α。8.如权利要求1至7中任一项所述的算法，其中，步骤c)包括以下步骤：相对于空载剂处理的对照细胞，针对所述细胞系中的每种亚型/或位点确定RNA编辑的基础水平，从而针对每种分子和每种编辑亚型/或编辑位点获得所述靶标的RNA编辑水平的平均/中位数相对比例。9.如权利要求1至8中任一项所述的算法，其中，所述方法是用于体外预测药物或化合物无风险或者以低风险或高风险诱导特定效应的概率的方法。10.如权利要求1至8中任一项所述的算法，其中，所述分子集合由平衡比例的治疗性分子类型组成，每种分子注释有诱导所述特定效应的高风险和低风险评分。11.如权利要求1至10中任一项所述的算法，其中，步骤1)d)-i)包括对于每种亚型或其组合计算以下值的步骤：-对于所述特定效应而言至少60的灵敏度(Se％)和至少60％的特异性(Sp％)的最佳阈值；-阳性(PPV,％)和阴性(NPV,％)预测值，其用于评估真实存在[真阳性/(真阳性+假阳性]和真实缺失[真阴性/(真阴性+假阴性)]的比例。12.如权利要求1至11中任一项所述的算法，其中，在步骤c)中，所述RNA编辑谱通过包括以下的方法进行：-包括NGS文库制备的NGS法(下一代测序)，优选使用两步PCR法来选择性地对所述靶标的受关注序列片段(包含所述编辑位点)进行测序；...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·韦斯曼，S·范德兰，N·萨尔瓦塔特，F·莫丽娜，JF·普约尔，
申请(专利权)人：阿利瑟迪亚格公司，国家科研中心，
类型：发明
国别省市：法国,FR