本发明专利技术公开了一种大肠杆菌O157:H7的PSR检测引物、试剂盒及其检测方法。该引物包括检测引物Ft、Bt，以及加速引物IF、IB；其中，检测引物Ft的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；检测引物Bt的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；加速引物IF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；加速引物IB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明专利技术还提供了一种大肠杆菌O157:H7的PSR检测试剂盒，可在40分钟左右获得检测结果，同时确保检测的可靠性、特异性和灵敏度，特别适用中小型单位及现场检测，且对于提高重大群体疾病诊断率，早期的疾病诊断具有非常重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌O157:H7的PSR检测引物、试剂盒及其检测方法
本专利技术属于生物
，特别涉及一种大肠杆菌O157:H7的PSR检测引物、试剂盒及其检测方法。
技术介绍
对病原微生物进行准确的鉴定，对于由食源性微生物引发的食品安全事故及指导合理治疗方式具有重要的意义。目前微生物的检测鉴定方法主要分为以下三大类：分离培养鉴定法、免疫学检测及核酸检测。分离培养鉴定法操作繁琐、实验周期长，对实验人员专业水平要求高。免疫学检测手段则需要制备昂贵的单克隆抗体，对样本要求较高，对于复杂样本无法检测。而核酸检测则大多基于聚合酶链式反应(PCR)法和荧光定量PCR法，这两种方法需要昂贵的仪器设备，检测成本较高，不适合中小型单位和现场检测的应用。目前对于大肠杆菌O157的核酸检测主要采用PCR及环介导等温扩增技术。而目前应用最广泛的恒温扩增技术-LAMP也有它的局限性，如引物设计复杂、假阳性率高、试剂价高偏高，且由于日本知识产权的保护，我国在转化应用上局限性强。聚合酶螺旋反应(PolymeraseSpiralReaction,PSR)技术与其他核酸扩增技术相比，可以在等温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列，且操作简便，不需要精准的变温设备，成本较低，在食源性微生物检测领域显示出广阔的发展前景。因此，建立一种针对大肠杆菌O157:H7新型的具有独立知识产权的等温核酸扩增方法具有重要的意义。EscherichiacoliO157:H7是肠出血大肠杆菌最重要的血清型，主要通过食用污染的食物，如生的或绞碎的肉制品、生牛奶和受污染的蔬菜和芽菜向人类传播，感染人体后表现为相应的临床症状。轻度感染可引起腹部绞痛和腹泻，发烧和呕吐也可能出现，潜伏期一般为3～8天，10天即可自愈。重度感染则表现为出血性结肠炎，溶血性尿毒综合征。E.coliO157:H7感染剂量极低，食入不足五个细菌就可引起疾病，且病情发展快。自1982年美国首次发现因E.coliO157:H7引起的食物中毒以来，疫情开始扩散和蔓延，相继在中国、英国、加拿大、日本等多个国家引起发病，对人类健康构成了重大威胁。目前由E.coliO157:H7感染引起的食源性疾病已经成为世界性的卫生问题。因此有必要建立一种快速低成本的检测E.coliO157:H7的检测方法及其试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种大肠杆菌O157:H7的PSR检测引物。本专利技术的另一目的在于提供一种大肠杆菌O157:H7的PSR检测试剂盒。本专利技术的又一目的在于提供所述大肠杆菌O157:H7的PSR检测试剂盒的应用。本专利技术的再一目的在于提供一种大肠杆菌O157:H7的PSR检测方法。该方法具有灵敏度高、特异性好，操作简便快速，结果准确可靠，检测成本低，适合现场检测应用的特点。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种大肠杆菌O157:H7的PSR检测引物，包括检测引物Ft、Bt，以及加速引物IF、IB，其核苷酸序列如下所示：检测引物Ft:5’-TTGGCATCGTGTGGACAGGGTAGGACCGCAGAGGAAAGA-3’(SEQIDNO.1)；检测引物Bt：5’-TGGGACAGGTGTGCTACGGTTTCCACGCCAACCAAGATC-3’(SEQIDNO.2)；加速引物IF:5’-GTTTCGATGAGTTTATCTGC-3’(SEQIDNO.3)；加速引物IB:5’-TCAAAAGCACCCTATAGCTG-3’(SEQIDNO.4)。一种大肠杆菌O157:H7的PSR检测试剂盒，包括上述大肠杆菌O157:H7的PSR检测引物。所述的上述大肠杆菌O157:H7的PSR检测引物各引物(检测引物Ft、Bt，以及加速引物IF、IB)的浓度均为50μM。所述的大肠杆菌O157:H7的PSR检测试剂盒，还包括如下组分：A、2×反应缓冲液：40.0mM的Tris-HCl，20.0mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0mM的硫酸镁，0.2％(v/v)的Tween20，1.4M的甜菜碱，10.0mM的dNTPs(each)；B、BstDNA聚合酶；C、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。组分B中所述的BstDNA聚合酶优选为浓度为8U/μL的BstDNA聚合酶水溶液。组分C中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(DMSO)中，配置50μM的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配置1mM的氯化锰水溶液；(ii)取25μL50μM的钙黄绿素溶液与10μL1mM的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:8)。所述的大肠杆菌O157:H7的PSR检测试剂盒在检测大肠杆菌O157:H7中的应用。一种大肠杆菌O157:H7的PSR检测方法，包括如下步骤：(1)提取待检样品的细菌DNA作为模板DNA，并控制模板DNA水溶液的OD260/OD280值为1.8～2.0；(2)于65℃水浴中保温40～45分钟进行聚合酶螺旋扩增反应；其中，聚合酶螺旋扩增反应体系为26μL反应体系：2×反应缓冲液12.5μL，50μM的检测引物Ft和50μM的检测引物Bt各0.8μL，50μM的加速引物IF和50μM的加速引物IB各0.4μL，DNA模板2.0μL，8U/μL的BstDNA聚合酶1.0μL，加水补足至25μL；最后加入1μL的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液；(3)待反应完成后于80℃水浴中保温2分钟终止反应，然后用肉眼观察颜色变化，如颜色为黄色，说明待检样品中不含有大肠杆菌O157:H7；如颜色变为绿色，说明待检样品中含有大肠杆菌O157:H7。步骤(2)中所述的检测引物Ft的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，检测引物Bt的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，加速引物IF的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，加速引物IB的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。步骤(2)中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(DMSO)中，配置50μM的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配置1mM的氯化锰水溶液；(ii)取25μL50μM的钙黄绿素溶液与10μL1mM的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:8)。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本专利技术中所提供的针对E.coliO157:H7特异性靶序列rfbE所设计的聚合酶螺旋检测鉴定体系，解决现有技术中的方法所需周期长，灵敏度低，成本高，现场应用困难等缺陷。通过选择目标菌株的特异性序列rfbE(GenebankAccessionNo.JN578671.1)的保守区域，设计一对检测引物和一对加速引物及添加荧光染料构建聚合酶螺等温扩增反应体系，可在40分钟左右获得检测结果以缩短传统大肠杆菌的周期，同时确保检测的可靠性、特异性和灵敏度。这对于提高重大群体疾病诊断率，早期的疾病诊断具有非常重要的意义。(2)本专利技术中可以将检测时间减少到40～45分钟，同传统环介导等温扩增技术相比速断检测周期，对新型恒温扩增技术扩增的开发及微生物的现场检测具有重要的意义。(3)本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种大肠杆菌O157:H7的PSR检测引物，其特征在于：包括检测引物Ft、Bt，以及加速引物IF、IB；其中，检测引物Ft的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；检测引物Bt的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；加速引物IF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；加速引物IB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌O157:H7的PSR检测引物，其特征在于：包括检测引物Ft、Bt，以及加速引物IF、IB；其中，检测引物Ft的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；检测引物Bt的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；加速引物IF的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；加速引物IB的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。2.一种大肠杆菌O157:H7的PSR检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的大肠杆菌O157:H7的PSR检测引物。3.根据权利要求2所述的大肠杆菌O157:H7的PSR检测试剂盒，其特征在于：所述的上述大肠杆菌O157:H7的PSR检测引物各引物的浓度均为50μM。4.根据权利要求3所述的大肠杆菌O157:H7的PSR检测试剂盒，其特征在于，还包括如下组分：A、2×反应缓冲液：40.0mM的Tris-HCl，20.0mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0mM的硫酸镁，0.2％(v/v)的Tween20，1.4M的甜菜碱，10.0mM的dNTPs；B、BstDNA聚合酶；C、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。5.根据权利要求4所述的大肠杆菌O157:H7的PSR检测试剂盒，其特征在于，组分C中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液为通过如下方法制备得到：(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜中，配置50μM的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配置1mM的氯化锰水溶液；(ii)取25μL50μM的钙黄绿素溶液与10μL1m...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘君彦，徐振波，徐行勇，徐瑞瑞，刘丽艳，苏健裕，李冰，李琳，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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