一种利用属特异性引物定量检测污损早期涂层表面菌属附着程度的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种利用属特异性引物定量检测污损早期不同涂层表面6种菌属附着程度的方法，该方法包含以下步骤：(1)以海上挂板表面样品中测得的6种菌属(不动杆菌属(Acinetobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、超微细菌属(Glaciecola)、简纳西氏菌属(Jannaschia)、红球菌属(Rhodococcus)、亚硫酸盐杆菌属(Sulfitobacter))为对象，设计对应的特异性引物；(2)污损早期不同涂层表面海水污损样本的采集和宏基因组提取；(3)利用特异性引物进行PCR扩增来定量检测6种对应菌属的附着程度。本发明专利技术基于海洋污损原核生物的全基因组序列中的特异性序列设计种、属特异性引物，为在种、属水平上检测样品中污损微生物群落结构动态变化提供了高效、快速的技术手段。

【技术实现步骤摘要】
一种利用属特异性引物定量检测污损早期涂层表面菌属附着程度的方法
本专利技术属于生物
，涉及一种利用属特异性引物定量检测污损早期不同涂层表面6种污损微生物菌属附着程度的方法。该方法为检测样品中污损微生物群落结构动态变化提供了高效、快速的技术手段，能够应用于检测不同海洋工程表面涂层污损微生物的附着程度。
技术介绍
海洋生物污损给全世界海洋产业的发展带来严重危害，极大程度上限制了人类对于海洋资源的开发和利用，海洋防污成为亟待解决的重要问题。很多研究表明，海洋早期污损微生物群落对于污损后期大型污损生物幼虫的定性附着具有重要影响。因此，定量检测污损早期不同涂层表面损微生物菌属附着程度非常重要，对污损生物早期附着的过程的研究是防污损技术开发的重要基础。目前关于污损生物的研究大多集中于污损生物生态学和防污技术方面，对于污损生物早期附着的过程的研究仍然不足。而想要对污损早期涂层表面污损微生物附着过程进行检测，分子标记方法成为首选的技术手段。该方法能够避开生物形态结构差异的干扰，直接通过检测生物体内大分子包含的稳定遗传信息，定量描述、分析附着情况，在相当程度上提高了鉴定主要海洋污损早期生物物种的准确度和效率。污损微生物菌属的附着程度检测至少在如下几个方面非常重要:(1)快速比较一批防污涂层在海洋污损早期抑制污损微生物附着能力的差异；(2)比较某个涂层在室内微生物纯培养体系中污损微生物附着率与实际海水中污损微生物附着率的差异。(3)优质涂层抑制海洋污损的机制研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用属特异性引物定量检测污损早期不同涂层表面6种污损微生物菌属附着程度的方法。测定的特异性是由6种与之对应的特异性引物来保障的。通过这些引物可以确保污损微生物菌属扩增的特异性。扩增结果可以通过qPCR或一般PCR结束后的凝胶扫描来实现定量检测。本专利技术是通过以下技术方案来实现：(1)以海上挂板表面样品中测得的6种菌属为对象，设计对应的特异性引物；(2)污损早期，不同涂层表面海水污损样本的采集和基因组提取；(3)利用6种特异性引物对上述基因组样本进行PCR扩增来定量检测6种对应菌属的附着程度。6种菌属的特异性引物设计方法如下：查找6种海洋污损微生物的全基因组，以全基因组中的特异性序列为基础，以属或种的分类学地位划分找到每个属或种的特异性基因片段，根据这段特异性基因片段，利用软件设计只可以扩增出该属或种片段的特异性引物。通过这些引物可以确保污损微生物菌属扩增的特异性。扩增结果可以通过qPCR或一般PCR结束后的凝胶扫描来实现定量检测。上述有关步骤的具体内容如下：(1)设计6类污损微生物菌属对应的特异性引物：首先从IntegratedMicrobialGenomes(IMG)【BallariniA，SegataN，HuttenhowerC，etal.SimultaneousquantificationofmultiplebacteriabytheBactoChipmicroarraydesignedtotargetspecies-specificmarkergenes[J].PloSone，2013，8(2)：e55764.】数据库获得并下载所有细菌和古细菌的核酸序列,共2887条。为了保证获得的是全基因组数据，需要对这些序列进行一个筛选。首先，序列的长度要大于50000nt，编码基因序列的个数也要大于50。除此之外，编码基因占编码序列的百分比也需要大于75％，同时该序列在NCBI的分类学标识必须能够确定在属和种的层面上。经过以上四个条件的筛选，初步确定获得的是细菌和古细菌的全基因组数据，最终筛选出共计2834个基因组序列。对于这些得到的每一个基因组，第一步，找出该基因组的所有的编码基因，聚集成一个基因群集。这个基因群集代表了这个基因组。把基因群集中的基因进行分组，形成一个个的genecore(核心基因家族)；所有物种的基因组只基因群集都进行这些genecores的分组。然后找出来各个物种在不同genecores中的特异性基因。对于一个给定的物种，使用UCLUST[17]工具计算该物种的基因组的‘cores’与所有其他基因组的同源性。为了增加genecore识别的鲁棒性，每一个分支特异的核心基因家族要与所有的原始基因组进行blast比对，目的是识别核心基因中一些在该分支中不是特异性的，同时把他们从后续标记基因列表中删除。用这种方法，我们可以排除掉一些基因，比如16SrRNA以及其他一些在分类学上普遍存在的基因。为了对基因的特异性进行一个比较，我们设置了一些blast比对参数，(1)1E-50<e-value<1E-5，(2)20<minimumalignmentlength<50。对每一个物种，重复执行以上三步，我们最终得到所有物种的特异性基因，再从特异性基因名单中随机选择第一个基因并利用Primer-BLAST网站设计1-3对特异性的引物。合成这1-3对引物并使用海洋污损样本进行PCR扩增，扩增产物经过测序确定就是该目标物种的话，则对应的引物才可以定为该物种的物种特异性引物。使用上述步骤也可以把引物设计到属的层面上得到属特异性引物。但是属特异性引物扩增出来的PCR产物需要经过TA克隆【】得到一批阳性克隆的菌落，通过进一步的菌落PCR扩增和测序(至少对15个克隆进行测序)判断这些阳性克隆中的插入序列都是目标属的物种序列才可以满足属特异性引物的要求。利用上述文献提供的方法流程，得到具有全基因组污损生物物种共78个，其中细菌界(原核生物)有67个，真菌界有5个，真核动物有6个。对他们进行特异性基因寻找，结果如表格1.表1有特异性基因的物种及特异性基因个数序号有属特异性基因的物种名单序列个数序号有种特异性基因的物种名单序列个数1Rhodococcus161Polaribacterirgensii3322Pantoea842Pseudomonasfluorescens373Oscillatoria3043Pseudomonasaeruginosa2844Pseudomonas634VibrioHarveyi2945Octadecabacter3385Loktanellavestfoldensis3266Rhodobacter256Agrobacteriumtumefaciens3307Roseobacter3517Acinetobacterjohnsonii3508Sulfitobacter3468Acinetobacterlwoffii3489Lyngbya3399Aeromonashydrophila35010Brevundimonas3610Bacilluscereus3711Caulobacter13712Delftia34213Arthrobacter3614Agrobacterium33115Jannaschia35016Cellulophaga2817Flavobacterium3018Acinetobacter3719Glaciecola35020Cytophaga69721Exiguobacterium37针对上述属特异性基因和种特异性基因各设计一对引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用属特异性引物定量检测污损早期不同涂层表面6种菌属附着程度的方法，该方法包含以下步骤：(1)以海上挂板表面污损样品中测得的6种菌属为对象，设计对应的特异性引物；(2)污损早期不同涂层表面海水污损样本的采集和基因组提取；(3)利用6种特异性引物对上述基因组样本进行PCR扩增来定量检测6种对应菌属的附着程度。

【技术特征摘要】
1.一种利用属特异性引物定量检测污损早期不同涂层表面6种菌属附着程度的方法，该方法包含以下步骤：(1)以海上挂板表面污损样品中测得的6种菌属为对象，设计对应的特异性引物；(2)污损早期不同涂层表面海水污损样本的采集和基因组提取；(3)利用6种特异性引物对上述基因组样本进行PCR扩增来定量检测6种对应菌属的附着程度。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：6种菌属的特异性引物设计方法如下：查找全部已知的海洋污损微生物的全基因组，以全基因组中的特异性序列为基础，以属或种的分类学地位划分找到每个属或种的特异性基因片段，根据这段特异性基因片段，利用软件设计只可以扩增出该属或种片段的特异性引物。依据上述技术路线为6种菌属设计特异性引物。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所设计的6种菌属的特异性引物为：不动杆菌属(Acinetobacter)：Acis1FCTTTATCGTGAACTGAGAGAAGAAGTCAcis1RCTTTACGGTATACATCTCGCTTAAAAT黄杆菌属(Flavobacterium)：Flas1FTTAGTTAAAGAAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：谷庆泽，张艾涵，张治洲，宋媛，李凯强，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学威海，
类型：发明
国别省市：山东,37