一种猪细小病毒的增殖方法技术

本发明专利技术涉及一种猪细小病毒的增殖方法，将猪细小病毒接种于ST细胞，进行细胞培养至90%~100%细胞出现病变；反复冻融使宿主细胞破碎，离心去除细胞碎片，收集上清液；将上清液、牛血清白蛋白、甘露醇和/或甘氨酸、L‑精氨酸混匀，然后进行冷冻干燥；其中，牛血清白蛋白（BSA）占混合液总质量的1~2%，甘露醇和/或甘氨酸占混合液总质量的1~3%，L‑精氨酸占混合液总质量的0.5~3%。本发明专利技术提供的猪细小病毒的增殖方法，工艺简便、传代次数少，在病毒去除/灭活验证具有广泛应用前景。增殖后的病毒滴度不低于10

【技术实现步骤摘要】
一种猪细小病毒的增殖方法
本专利技术属于微生物应用领域病毒培养技术，具体涉及一种猪细小病毒的增殖方法。
技术介绍
培养基是维持体外细胞生存和生长的基本溶液，合成培养基中一般含有必需氨基酸，这些对细胞生长、病毒增殖都有影响。氨基酸作为一类能够提高病毒滴度的物质，在相同的培养条件下，添加少量氨基酸即可获得更高滴度的病毒。冷冻干燥或“冻干”是用于去除水分的技术方法。其中，含水溶液在其共晶点以下被冷却，直至其完全被冷冻。之后，将大气压降至真空，使得水升华并从溶液中脱出。被溶解的因子保持为多孔固体，之后其可再次溶于水。因此冷冻干燥也可以作为浓缩的一种手段。猪细小病毒(Porcineparvovirus，PPV)属于细小病毒科(Parvoviridae)细小病毒属(Parvovirus)，是引起母猪繁殖障碍疾病的主要病原之一，可导致母猪流产、早产、产死胎、木乃伊胎、弱仔及母猪不育和新生仔猪大量死亡。PPV对热具有较强抵抗力，56℃48小时、70℃2小时病毒的感染性和血凝性均无明显改变；对酸碱有较强的抵抗力，在pH3.0～9.0之间稳定；能抵抗乙醚、氯仿等脂溶剂；甲醛蒸气和紫外线需要相当长的时间才能杀死该病毒。PPV作为一类无包膜、单股DNA基因组和强抵抗力的病毒，在血液制品、生物制品和动物源性医疗器械的病毒去除/灭活验证中，具有广泛的应用。在病毒去除/灭活验证中，指示病毒的滴度需达到106TCID50以上，但猪细小病毒在不同的细胞上增殖效果不尽相同，出现病变的时间、病变特征、病变观察的难易程度、病毒含量和血凝价均有所差别，如不能掌握其规律选择最佳的细胞系进行病毒的培养及培养技术，将很难培养出高的的滴度。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种猪细小病毒的增殖方法，培养出的病毒滴度高。为解决以上技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种猪细小病毒的增殖方法，包括如下步骤：(1)将猪细小病毒接种于ST细胞，进行细胞培养至90％～100％细胞出现病变；(2)反复冻融使宿主细胞破碎，离心去除细胞碎片，收集上清液；(3)将所述的上清液、牛血清白蛋白、甘露醇和/或甘氨酸、L-精氨酸混匀得到混合液，然后将所述的混合液进行冷冻干燥；其中，所述的牛血清白蛋白(BSA)占所述的混合液总质量的1～2％，所述的甘露醇和/或甘氨酸占所述的混合液总质量的1～3％，所述的L-精氨酸占所述的混合液总质量的0.5～3％。优选地，所述的牛血清白蛋白占所述的混合液总质量的1.5～2％。优选地，所述的甘露醇和/或甘氨酸占所述的混合液总质量的2.5～3％。优选地，所述的L-精氨酸占所述的混合液总质量的2.5～3％。优选地，所述的增殖方法还包括将冷冻干燥后的病毒用含1～3wt％胎牛血清的MEM培养基复溶至所述的上清液体积的5～15％的步骤。优选地，步骤(1)中，采用含1～3wt％胎牛血清(FBS)的MEM培养基进行所述的细胞培养。优选地，步骤(1)的具体实施方式为：将猪细小病毒主代毒种，用不含胎牛血清的培养基稀释至10-1～10-2，然后取1～2mL接种于ST细胞中，吸附0.5～1.5h使PPV病毒悬液与细胞充分接触，加入含1～3wt％胎牛血清的MEM培养基10～15ml，进行所述的细胞培养。进一步优选地，所述的不含胎牛血清的培养基为MEM培养基。优选地，步骤(1)中，所述的ST细胞的制备方法为：将冻存的ST细胞复融后，取1mL细胞悬液逐滴滴加含8～12wt％胎牛血清的MEM培养基4～6mL，混匀后25℃、3000rpm、离心5min去除上清液，再补加含8～12wt％胎牛血清的MEM培养基8～12mL，摇匀，放入37℃、5％CO2培养箱中孵育至细胞长满单层。由于以上技术方案的实施，本专利技术与现有技术相比具有如下优势：本专利技术提供的猪细小病毒的增殖方法，工艺简便、传代次数少，在病毒去除/灭活验证具有广泛应用前景。增殖后的病毒滴度不低于106.0TCID50/0.1ml，显著高于现行技术培养的猪细小病毒的滴度。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。应理解，这些实施例是用于说明本专利技术的基本原理、主要特征和优点，而本专利技术不受以下实施例的限制。实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。实施例11、细胞传代：从液氮中取出冻存的ST细胞，在37℃水浴中迅速融化，用无菌移液管移至离心管中，逐滴滴加含10wt％FBS的MEM培养基至5mL，吹吸数次，混匀，立即离心(3000rpm，5min)，去上清液。再加入10mL的10wt％FBS的MEM培养基，吹吸数次，混匀后转种于加有10mL含10wt％FBS的MEM培养基的T25培养瓶中，放置于37℃、5％CO2培养箱中培养，培养24h～48h，当细胞长满单层时，用于扩增病毒和病毒滴度测定。2、PPV的扩增：从-70℃冰箱(工作病毒库)取出冻存的PPV病毒主代毒种，室温融化，用不含FBS的MEM培养基作10倍稀释，然后取1mL接种于已经长满单层ST细胞的细胞瓶内，置37℃、5％CO2培养箱中，吸附1h，加入含2wt％FBS的MEM培养基，至37℃、5％CO2培养箱内培养，待3/4细胞出现病变时，取出。将含有病毒及宿主细胞的培养基，放置于-20℃反复冻融3次破碎宿主细胞，释放病毒，然后，4℃离心(3000rpm，10min)去除细胞碎片，上清液即为所需的病毒悬液。小瓶分装上清液，置于-70℃冰箱冷冻备用。3、PPV的冻干：在上清液中加入牛血清白蛋白(终浓度为1wt％)、甘露醇(终浓度为1wt％)、L-精氨酸(终浓度为0.5wt％)，混匀后置于冷冻干燥机中冻干，将冻干后的病毒用含2wt％FBS的MEM培养基复溶至冻干前上清液体积的10％。实施例2与实施例1基本相同，不同之处在于：向上清液中加入牛血清白蛋白至终浓度为2wt％，甘露醇至终浓度为3wt％，L-精氨酸至终浓度为3wt％。实施例3与实施例1基本相同，不同之处在于：向上清液中加入牛血清白蛋白至终浓度为1wt％，甘氨酸至终浓度为1wt％，L-精氨酸至终浓度为0.5wt％。试验例1：增殖后的病毒滴度将实施例1至3中复溶后的病毒液用含2wt％胎牛血清的MEM培养基进行10倍系列稀释至10-9，接种至已种好ST细胞的96孔培养板中，每个稀释度各接种8孔，每孔100μL，同时设细胞对照孔，置37℃、5％CO2培养箱中培养。在48h和96h时取出换液(含2wt％FBS的MEM培养基)，到120h时取出置于显微镜下观察，逐孔记录细胞病变情况，按Reed-Muench法计算TCID50。结果见表1。试验例2：增殖后室温放置24h后的病毒滴度将实施例1至3中复溶后的病毒液在室温下放置24h，然后用含2wt％胎牛血清的MEM培养基进行10倍系列稀释至10-9，接种至已种好ST细胞的96孔培养板中，每个稀释度各接种8孔，每孔100μL，同时设细胞对照孔，置37℃、5％CO2培养箱中培养。在48h和96h时取出换液(含2wt％FBS的MEM培养基)，到120h时取出置于显微镜下观察，逐孔记录细胞病变情况，按Reed-Muench法计算TCID50。结果见表1。试验例3：增殖后2～8℃放置24h后的病毒滴度将实施例1至3中复溶后的病毒液在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪细小病毒的增殖方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）将猪细小病毒接种于ST细胞，进行细胞培养至90%~100%细胞出现病变；（2）反复冻融使宿主细胞破碎，离心去除细胞碎片，收集上清液；（3）将所述的上清液、牛血清白蛋白、甘露醇和/或甘氨酸、L‑精氨酸混匀得到混合液，然后将所述的混合液进行冷冻干燥；其中，所述的牛血清白蛋白占所述的混合液总质量的1~2%，所述的甘露醇和/或甘氨酸占所述的混合液总质量的1~3%，所述的L‑精氨酸占所述的混合液总质量的0.5~3%。

【技术特征摘要】
1.一种猪细小病毒的增殖方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）将猪细小病毒接种于ST细胞，进行细胞培养至90%~100%细胞出现病变；（2）反复冻融使宿主细胞破碎，离心去除细胞碎片，收集上清液；（3）将所述的上清液、牛血清白蛋白、甘露醇和/或甘氨酸、L-精氨酸混匀得到混合液，然后将所述的混合液进行冷冻干燥；其中，所述的牛血清白蛋白占所述的混合液总质量的1~2%，所述的甘露醇和/或甘氨酸占所述的混合液总质量的1~3%，所述的L-精氨酸占所述的混合液总质量的0.5~3%。2.根据权利要求1所述的猪细小病毒的增殖方法，其特征在于：所述的牛血清白蛋白占所述的混合液总质量的1.5~2%。3.根据权利要求1所述的猪细小病毒的增殖方法，其特征在于：所述的甘露醇和/或甘氨酸占所述的混合液总质量的2.5~3%。4.根据权利要求1所述的猪细小病毒的增殖方法，其特征在于：所述的L-精氨酸占所述的混合液总质量的2.5~3%。5.根据权利要求1所述的猪细小病毒的增殖方法，其特征在于：所述的增殖方法还包括将冷冻干燥后的病毒用含1~3wt%胎牛血清的MEM...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴娟，缪汝娉，鲍大为，
申请(专利权)人：苏州良辰生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32