一种交联生物酶催化剂及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种交联生物酶催化剂及其应用，通过以下方法制备：将牛血清白蛋白溶于磷酸盐缓冲液中，得到牛血清白蛋白溶液，再加入南极假丝酵母脂肪酶B溶液搅拌，得到酶‑蛋白混合液，加入沉淀剂和交联剂，在冰水浴条件下搅拌，收集固形体，用磷酸盐缓冲液洗涤固形体，得到交联酶聚体，加入磷酸盐缓冲液进行分散，再加入交联剂，在冰水浴条件下搅拌，得到醛基修饰的交联酶聚体，加入南极假丝酵母脂肪酶B溶液，在冰水浴条件下搅拌，离心收集产物，洗涤、冻干后，即得到产品。制备的交联生物酶催化剂在动力学拆分和动态动力学拆分α‑苯乙胺中表现出优异的催化活性，呈现出稳定性高、可分离回收、可重复利用、工艺简单、价格低廉等一系列优点。

A cross-linked enzyme catalyst and its application

The invention relates to a cross-linking bio-enzyme catalyst and its application, which is prepared by dissolving bovine serum albumin in phosphate buffer solution, obtaining bovine serum albumin solution, stirring with Candida antarctica lipase B solution, obtaining a mixed enzyme-protein solution, adding precipitator and cross-linking agent, and bathing in ice water strip. The cross-linked enzymes were obtained by stirring, collecting solid bodies, washing solid bodies with phosphate buffer, adding phosphate buffer to disperse them, then adding cross-linking agent, stirring in ice-water bath to obtain aldehyde-modified cross-linked enzymes, adding Candida antarctica lipase B solution and stirring in ice-water bath. After centrifugation, the product is obtained after washing and freeze-drying. The prepared cross-linked enzyme catalysts exhibit excellent catalytic activity in kinetic resolution and dynamic kinetic resolution of alpha phenylethylamine, showing a series of advantages such as high stability, separation and recovery, reusability, simple process and low cost.

【技术实现步骤摘要】
一种交联生物酶催化剂及其应用
本专利技术属于催化剂
，具体涉及一种交联生物酶催化剂及其应用。
技术介绍
α-苯乙胺是一种十分重要的化学化工中间体原料，它的光学单一对映体(R)-α-苯乙胺和(S)-α-苯乙胺不仅可以用作许多外消旋有机酸、醇、酯或酚类化合物的手性拆分试剂，还可以用作手性助剂和不对称合成的手性原料，用途十分广泛。光学纯α-苯乙胺的衍生物也广泛应用于医药、香料、染料及乳化剂等领域，有十分良好的应用前景。目前制备光学纯的α-苯乙胺主要是通过不对称合成和拆分的方法。不对称合成主要是通过化学反应向反应物分子中引入一个或者多个具有手性中心的分子，具体又可以分为应用手性催化剂法、添加手性助剂法以及使用手性试剂法。但不对称合成工艺复杂繁琐、成本昂贵的缺点限制了它的工业应用。拆分又包括动力学拆分和动态动力学拆分，动力学拆分法是一种经典分离方法，生产成本相对较低，是工业生产制备单一光学活性体的最有效方法之一。目前拆分α-苯乙胺主要采用酶拆分法，常用酶为南极假丝酵母脂肪酶B。动态动力学拆分是将底物的外消旋反应与动力学拆分同时一锅联用的拆分反应，在动力学拆分的基础上多了一步将剩余反应底物同步消旋的反应，克服了动力学拆分最高理论得率50％的缺陷，理论上可以使手性底物全部转化为目标产物，实现100％的转化。固定化酶因比游离酶呈现出更高的热稳定性、化学稳定性、操作连续可控、可重复利用以及易分离等一系列优点，已被广泛应用于生物催化领域。但固定化酶因其载体所占比例较大，造成酶活力被稀释，从而引起产品率下降，因此固定化酶开始转向无载体固定化方法制备交联酶聚体。传统交联酶聚体工艺简单，首先通过沉淀剂使酶分子之间彼此靠近聚集，然后使用交联剂将沉淀出的酶分子聚集体进行交联制得酶聚体。工业中常使用戊二醛作交联剂，其作用机制为戊二醛的醛基与酶分子中的氨基发生席夫碱反应。对于自身氨基较少的酶来说，因其交联作用太弱所以常加入氨基含量多的蛋白保护剂进行辅助交联。但制备的酶聚体活性位大多在内部，导致其催化大分子底物反应时会受到严重的传质限制，影响酶活。因此，制备得到一种不限制底物传输的交联生物酶催化剂，对于动力学拆分和动态动力学拆分外消旋α-苯乙胺具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了解决上述问题而提供一种交联生物酶催化剂及其应用。本专利技术的目的通过以下技术方案实现：一种交联生物酶催化剂，该交联生物酶催化剂通过以下方法制备得到：(1)将牛血清白蛋白溶于磷酸盐缓冲液中，得到牛血清白蛋白溶液，再加入南极假丝酵母脂肪酶B溶液搅拌，得到酶-蛋白混合液；(2)向酶-蛋白混合液中加入沉淀剂和交联剂，在冰水浴条件下搅拌，收集固形体，用磷酸盐缓冲液洗涤固形体，除去多余沉淀剂和交联剂后，得到交联酶聚体；(3)向交联酶聚体中加入磷酸盐缓冲液进行分散，再加入交联剂，在冰水浴条件下搅拌，得到醛基修饰的交联酶聚体；(4)向醛基修饰的交联酶聚体中加入南极假丝酵母脂肪酶B溶液，在冰水浴条件下搅拌，离心收集产物，洗涤、冻干后，即得到产品。优选地，步骤(1)所述牛血清白蛋白的浓度为25-75mg/mL。优选地，步骤(1)所述磷酸盐缓冲液浓度为20mM，pH＝7.5。优选地，步骤(1)及步骤(4)所述南极假丝酵母脂肪酶B的浓度为8mg/mL，南极假丝酵母脂肪酶B的体积与牛血清白蛋白的质量的比为1L/50-150g。优选地，步骤(1)所述牛血清白蛋白的质量与磷酸盐缓冲液的体积比为50-150g/2L，步骤(3)所述牛血清白蛋白的质量与磷酸盐缓冲液的体积比为50-150g/3L。优选地，步骤(2)所述沉淀剂为硫酸铵，硫酸铵的质量与牛血清白蛋白的质量比为7-22。优选地，步骤(2)与步骤(3)所述交联剂为戊二醛，步骤(2)交联剂的加入体积与牛血清白蛋白的质量比为3-7μL/5-15mg，步骤(3)交联剂的加入体积与牛血清白蛋白的质量比为1μL/1-3mg。优选地，步骤(2)在冰水浴条件下搅拌进行交联反应的时间为2h。优选地，步骤(4)在冰水浴条件下搅拌进行交联反应的时间为1h。所述交联生物酶催化剂应用于动力学拆分α-苯乙胺或动态动力学拆分α-苯乙胺，动态动力学拆分α-苯乙胺的反应中所用金属催化剂为工业化的pd/C催化剂。本专利技术采用二次交联固载技术，通过沉淀剂和交联剂，将酶和蛋白的聚集体进行交联之后，在形成的交联酶聚体表面再一次修饰交联剂，使生物酶与酶聚体之间再进行相互交联形成的生物催化剂，制备得到的交联生物酶催化剂在动力学拆分和动态动力学拆分α-苯乙胺中表现出优异的催化活性，有效地改善了传统交联酶聚体对大分子底物的传质限制，呈现出稳定性高、可分离回收、可重复利用、工艺简单、价格低廉等一系列优点。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术制备的交联生物酶催化剂，通过两次交联的方式，使制得的酶聚体内外都能暴露出南极假丝酵母脂肪酶的活性位，在动力学拆分和动态动力学拆分α-苯乙胺中表现出优异的催化活性，改善传统交联酶聚体对大分子底物的传质限制，稳定性高、可分离回收，重复使用5次仍能保持较高的拆分和动态动力学拆分效率。(2)本专利技术的制备工艺简单、条件温和、原材料易得、价格低廉、对环境无污染。附图说明图1为实施例1制备的交联生物酶催化剂的SEM图片。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细说明。实施例1将50mg牛血清白蛋白溶于2mL磷酸盐缓冲液中，并加入1mL南极假丝酵母脂肪酶溶液，搅拌均匀后加入硫酸铵1.083g和戊二醛(50wt％)30μL，冰水浴条件下搅拌2小时后离心，收集固形体，并用磷酸盐缓冲液反复洗涤，得到交联酶聚体。然后加3mL磷酸盐缓冲液对交联酶聚体进行分散，搅拌均匀后加50μL戊二醛(50wt％)，在冰水浴条件下继续搅拌30分钟，加入南极假丝酵母脂肪酶溶液1mL，冰水浴条件下搅拌1小时进行第二次交联，离心后洗涤，放入冷冻干燥机中冻干，样品标记为Com-CLEAs-1，图1为制备的交联生物酶催化剂的SEM图片。实施例2将100mg牛血清白蛋白溶于2mL磷酸盐缓冲液中，并加入1mL南极假丝酵母脂肪酶溶液，搅拌均匀后加入硫酸铵1.083g和戊二醛(50wt％)30μL，冰水浴条件下搅拌2小时后离心，收集固形体，并用磷酸盐缓冲液反复洗涤，得到交联酶聚体。然后加3mL磷酸盐缓冲液对交联酶聚体进行分散，搅拌均匀后加50μL戊二醛(50wt％)，在冰水浴条件下继续搅拌30分钟，加入南极假丝酵母脂肪酶溶液1mL，冰水浴条件下搅拌1小时进行第二次交联，离心后洗涤，放入冷冻干燥机中冻干，样品标记为Com-CLEAs-2。实施例3将150mg牛血清白蛋白溶于2mL磷酸盐缓冲液中，并加入1mL南极假丝酵母脂肪酶溶液，搅拌均匀后加入硫酸铵1.083g和戊二醛(50wt％)30μL，冰水浴条件下搅拌2小时后离心，收集固形体，并用磷酸盐缓冲液反复洗涤，得到交联酶聚体。然后加3mL磷酸盐缓冲液对交联酶聚体进行分散，搅拌均匀后加50μL戊二醛(50wt％)，在冰水浴条件下继续搅拌30分钟，加入南极假丝酵母脂肪酶溶液1mL，冰水浴条件下搅拌1小时进行第二次交联，离心后洗涤，放入冷冻干燥机中冻干，样品标记为Com-CLEAs-3。实施例4将100mg牛血清白蛋白溶于2mL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种交联生物酶催化剂，其特征在于，该交联生物酶催化剂通过以下方法制备得到：(1)将牛血清白蛋白溶于磷酸盐缓冲液中，得到牛血清白蛋白溶液，再加入南极假丝酵母脂肪酶B溶液搅拌，得到酶‑蛋白混合液；(2)向酶‑蛋白混合液中加入沉淀剂和交联剂，在冰水浴条件下搅拌，收集固形体，用磷酸盐缓冲液洗涤固形体，除去多余沉淀剂和交联剂后，得到交联酶聚体；(3)向交联酶聚体中加入磷酸盐缓冲液进行分散，再加入交联剂，在冰水浴条件下搅拌，得到醛基修饰的交联酶聚体；(4)向醛基修饰的交联酶聚体中加入南极假丝酵母脂肪酶B溶液，在冰水浴条件下搅拌，离心收集产物，洗涤、冻干后，即得到产品。

【技术特征摘要】
1.一种交联生物酶催化剂，其特征在于，该交联生物酶催化剂通过以下方法制备得到：(1)将牛血清白蛋白溶于磷酸盐缓冲液中，得到牛血清白蛋白溶液，再加入南极假丝酵母脂肪酶B溶液搅拌，得到酶-蛋白混合液；(2)向酶-蛋白混合液中加入沉淀剂和交联剂，在冰水浴条件下搅拌，收集固形体，用磷酸盐缓冲液洗涤固形体，除去多余沉淀剂和交联剂后，得到交联酶聚体；(3)向交联酶聚体中加入磷酸盐缓冲液进行分散，再加入交联剂，在冰水浴条件下搅拌，得到醛基修饰的交联酶聚体；(4)向醛基修饰的交联酶聚体中加入南极假丝酵母脂肪酶B溶液，在冰水浴条件下搅拌，离心收集产物，洗涤、冻干后，即得到产品。2.根据权利要求1所述的一种交联生物酶催化剂，其特征在于，步骤(1)所述牛血清白蛋白的浓度为25-75mg/mL。3.根据权利要求1所述的一种交联生物酶催化剂，其特征在于，步骤(1)所述磷酸盐缓冲液浓度为20mM，pH＝7.5。4.根据权利要求1所述的一种交联生物酶催化剂，其特征在于，步骤(1)及步骤(4)所述南极假丝酵母脂肪酶B的浓度为8mg/mL，南极假丝酵母脂肪酶B的体积与牛血清白蛋白的质量的比为1L...

【专利技术属性】
技术研发人员：李辉，王萌，封波，李远华，韩昕宸，蓝梓桀，顾华军，
申请(专利权)人：上海师范大学，
类型：发明
国别省市：上海,31