本发明专利技术涉及对最新分离得到黄酮皂苷混源萜类化合物clinoposides G和H的药理作用进行了研究，发现化合物clinoposides G和H对缺氧复氧(A/R)诱导的H9c2心肌细胞损伤具有保护作用，可以显著提高细胞存活率，降低LDH释放，提高线粒体膜电位，减少细胞凋亡，降低炎性因子IFN‑γ、TNF‑α、IL‑6、MCP‑1活性。Westernblot分析发现其可以提高Nrf2核转位，降低NF‑кB的核转位。以上结果提示黄酮皂苷混源萜类化合物可能通过双重调节NF‑κB和Nrf2而显示出显著的心肌保护活性。
Application of a flavonoid saponin mixed terpenoid in pharmaceutical preparation
The present invention is concerned with the pharmacological effects of the newly isolated flavonoid saponin mixed terpenoids clinoposides G and H. It is found that the compounds clinoposides G and H have protective effects on hypoxia-reoxygenation (A/R)-induced injury of H9c2 cardiomyocytes, which can significantly improve cell survival rate, reduce LDH release and enhance mitochondrial membrane. Potential, reduce cell apoptosis, reduce inflammatory factors IFN, gamma, TNF, IL, 6, MCP 1 activity. Westernblot analysis showed that it could increase the nuclear translocation of Nrf2 and decrease the nuclear translocation of NF B. These results suggest that flavonoid saponins may show significant myocardial protective activity by dual regulation of NF_kB and Nrf2.
【技术实现步骤摘要】
一种黄酮-皂苷混源萜类化合物在药物制备中的应用
本专利技术涉及对植物中提取分离纯化从而得到具有生物活性的化合物的应用。具体是对唇形科植物风轮菜Clinopodiumchinense(Benth.)O.Kuntze的地上部分提取分离纯化得到的2个新化合物的制药用途。
技术介绍
心血管疾病已成为全世界第一位致死致残原因，心血管疾病具有发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高、并发症多的特点。发病形式多样，给人类社会带来了极大的痛苦和死亡威胁。近年来，国内外许多专家学者都在致力于发现预防和治疗心血管疾病的有效方法，而寻找高效低毒的防治心血管疾病的天然药物是科学工作者研究的热点课题之一。风轮菜(Clinopodiumchinense(Benth.)O.Kuntze)为唇形科风轮菜属植物，味微苦涩，性凉，归肝经，具有收敛止血的功效，常用于治疗各种出血症。现代研究表明，风轮菜主要含有黄酮、三萜皂苷、萜类、挥发油、甾体等，风轮菜提取物既有治疗糖尿病、冠心病以及心肌缺氧保护等作用。本课题组一直致力于从天然产物中寻找具有良好疗效的治疗和/或预防心血管疾病的药物。我们前期研究发现，风轮菜具有止血和活血的双向调节作用，在止血的同时又可以祛除已瘀之血，从而达到止血而不留淤的效果，治疗和/或预防心血管疾病方面具有独特的优势，有着良好的研究开发前景。由于风轮菜中含有众多化合物，其所含有的活性化合物的结构还不明确，目前还不知道是哪一种物质为活性物质，使其难以进行进一步的利用，因此，确定风轮菜中具体活性物质的结构和药理活性具有重要的意义。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术人进行了大量研究，从风轮菜正丁醇部位中得到2个黄酮皂苷混源萜类成分，均为新化合物。这2个新型混源萜类化合物分别命名为clinoposidesG和clinoposidesH。本专利技术的另一个目的是提供clinoposidesG和clinoposidesH在心肌细胞缺氧复氧损伤中的保护作用。一种黄酮-皂苷混源萜类化合物，名称为clinoposidesG(1)或clinoposidesH(2)，结构如下式所示：本专利技术还提供了一种所述的黄酮-皂苷混源萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：(1)将风轮菜地上部分粉碎后，用乙醇回流提取，减压回收乙醇，得到浸膏；(2)用水溶解此浸膏后，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取，对正丁醇提取液减压回收溶剂，得到正丁醇萃取物；(3)将正丁醇萃取物以D101大孔吸附树脂处理，依次以水-乙醇洗脱剂进行梯度洗脱，合并50-85％乙醇洗脱物，得到总皂苷；(4)将总皂苷部位经硅胶柱层析以氯仿：甲醇进行梯度洗脱，用薄层色谱进行检识合并相似组分得到FZ(A-H)8个部分，FZ-G经C18反相柱层析，以甲醇：水梯度洗脱，得到23个流分，经薄层示踪并合并相同组分，得到FZ-G(Fr.1-9)9个部分；(5)将FZ-G(Fr.6)进行SephadexLH-20羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，以甲醇为洗脱剂进行洗脱，得到4个流分FZ-G(Fr.6.1-6.4)，将其中的FZ-G(Fr.6.4)经过制备液相分离纯化得到化合物2clinoposidesH，保留时间为29min；(6)将FZ-G(Fr.8)进行SephadexLH-20羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，以甲醇为洗脱剂进行洗脱，得到5个流分FZ-G(Fr.8.1-8.5)，将其中的FZ-G(Fr.8.5)经过制备液相分离纯化得到化合物1clinoposidesG，保留时间为38min。作为优选，具体步骤如下：(1)风轮菜地上部分15kg粉碎后，以100L70％乙醇回流提取2次，每次两小时，减压回收乙醇，得到浸膏约3kg；(2)用水溶解此浸膏后，依次用石油醚萃取三次，每次2L，减压回收溶剂，得石油醚萃取物(FS，120g)；用乙酸乙酯萃取三次，每次6L，减压回收溶剂，得乙酸乙酯萃取物(FY，760g)，用正丁醇萃取三次，每次6L，减压回收溶剂，得正丁醇萃取物(FZ，350g)；(3)正丁醇萃取物以D101大孔吸附树脂处理，依次以水、20％乙醇、85％乙醇、95％乙醇洗脱，减压回收溶剂，合并50-85％乙醇洗脱物，得到总皂苷180g；(4)将总皂苷部位(180g)经硅胶柱层析以氯仿：甲醇(100:0～0:100)进行梯度洗脱，用薄层色谱进行检识合并相似组分得到FZ(A-H)8个部分；FZ-G(30g)经C18反相柱层析，以甲醇：水(30:70→90:10，v/v)梯度洗脱，得到23个流分，经薄层示踪并合并相同组分，得到FZ-G(Fr.1-9)9个部分；(5)将FZ-G(Fr.6,250mg)进行SephadexLH-20羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，以甲醇为洗脱剂进行洗脱，得到4个流分FZ-G(Fr.6.1-6.4)，FZ-G(Fr.6.4，30mg)经过制备液相分离纯化(流动相条件：甲醇-水72:28)得到化合物2(4.3mg)，保留时间为29min；(6)将FZ-G(Fr.8,320mg)进行SephadexLH-20羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，以甲醇为洗脱剂进行洗脱，得到5个流分FZ-G(Fr.8.1-8.5)，FZ-G(Fr.8.5，80mg)经过制备液相分离纯化(流动相条件：甲醇-水67:33)得到化合物1(8.2mg)，保留时间为38min。本专利技术提供的clinoposidesG和clinoposidesH在心肌细胞缺氧复氧损伤中的保护作用是通过以下方案获得的：先进行心肌细胞缺氧复氧损伤模型的建立，通过MTT法检测细胞的存活率，2,4-二硝基苯肼显色法检测LDH水平，双染荧光法检测细胞凋亡，试剂盒检测IFN-γ，MCP-1，TNF-α，IL-6的水平变化以及SOD，CAT的活性。具体试验过程包括以下步骤：(1)心肌细胞缺氧复氧损伤模型的建立将H9c2心肌细胞于37℃CO2的恒温培养箱中培养后，细胞融合度90％时用于实验。把细胞的培养液更换为PBS缓冲液，在含有95％的N2和5％的CO2缺氧培养箱培养，把缺氧复氧培养箱放入37℃的恒温培养箱中培养4h造成缺氧，然后换掉缓冲液，重新加入的培养基，放置于37°CO2的中培养24h，建立心肌细胞的缺氧复氧模型。对照组：培养的H9c2心肌细胞放入CO2的恒温培养箱培养，不做任何处理。(2)通过MTT法测定细胞存活率和LDH释放量的检测当心肌细胞融合度90％时用于实验，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度1000-10000每孔，细胞的边缘孔用无菌的PBS填充。5％CO2,37℃的恒温培养箱进行孵育至细胞单层铺满孔底，分别设置对照组(不做任何处理)，缺氧复氧模型组，给药组:clinoposidesG和clinoposidesH(5ug/ml，10ug/ml，20ug/ml)，培养到一定时间进行细胞存活率的测定。每孔加入10ulMTT,继续培养4h终止培养，小心吸出培养液，每孔加入150ul的二甲基亚枫，置摇床上低速震荡10分钟，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光度。各组处理结束后,收集细胞培养液及细胞,根据试剂盒说明书检测LDH的释放量；(3)通过TUNEL染色检测细胞凋亡(4)检测心肌细胞内IFN-γ,MCP-1,TNF-α和I本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种黄酮‑皂苷混源萜类化合物在药物制备中的应用，其特征在于，所述的黄酮‑皂苷混源萜类化合物名称为clinoposides G(1)或clinoposides H(2)，结构如下式所示：
【技术特征摘要】
1.一种黄酮-皂苷混源萜类化合物在药物制备中的应用，其特征在于，所述的黄酮-皂苷混源萜类化合物名称为clinoposidesG(1)或clinoposidesH(2)，结构如下式所示：2.根据权利要求1所述的黄酮-皂苷混源萜类化合物在药物制备中的应用，其特征在于，所述的药物用于预防或者治疗心血管疾病。3.根据权利要求1所述的黄酮-皂苷混源萜类化合物在药物制备中的应用，其特征在于，所述的药物用于保护心肌细胞损伤。4.根据权利要求3所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱寅荻，许旭东，余世春，王朝杰，胡臻，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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