本发明专利技术涉及一种黄花倒水莲细胞培养法制备皂苷类化合物的方法，包括以下步骤：（1）黄花倒水莲种子的获取；（2）黄花倒水莲种子的消毒及无菌苗的获得；（3）诱导黄花倒水莲愈伤组织形成；（4）将黄花倒水莲愈伤组织进行继代培养，获得疏松、稳定的愈伤组织；（5）将愈伤组织转移到液体培养基中进行振荡培养；（6）添加不同种类和不同浓度的诱导因子，筛选出高产细胞；（7）将高产悬浮细胞进行增殖培养；（8）愈伤组织或悬浮细胞的干燥和粉碎；（9）愈伤组织或悬浮细胞中总皂苷的萃取、纯化和测定。本发明专利技术可以生产出黄花倒水莲的次生代谢产物，生产成本低，不受季节和环境限制，周期短。
【技术实现步骤摘要】
一种黄花倒水莲细胞培养法制备皂苷类化合物的方法
本专利技术涉及一种悬浮细胞培养法制备生物药物的方法，具体地说是一种利用黄花倒水莲愈伤组织或悬浮细胞生产皂苷类化合物的方法，属于植物生物
技术介绍
黄花倒水莲（PolygalafallaxDunn）属远志科远志属，灌木或小乔木，大而长的黄色总状花序异常美丽，分布于湖南、福建、广西、江西、广东和云南，生于山坡疏林下或沟谷丛林中。黄花倒水莲属珍贵中药材，有“土党参”“黄花参”等美称，其根能滋补、强壮、祛风湿和舒经络，治病后体虚、腰肌劳损、风湿关节痛、跌打损伤、急慢性肝炎、子宫下垂和月经不调。黄花倒水莲在早期民间就有药用价值的认识，近年来因为野生资源不停的被发掘使用，对其药用价值的日益注重，市场需求量逐渐增大，致使其成为近年来药材市场上畅销种类，价格不断地上涨。而目前栽培主要是以种子繁殖，种子产量低，扦插繁殖成活率也低，收获困难，野生资源十分有限，导致资源严重不足。因而，建设一种较为合理、完善的黄花倒水莲组培系统，大规模快速生产黄花倒水莲育苗迫在眉睫。用植物器官、组织、细胞离体培养诱导愈伤组织进一步诱导器官再生或胚状体而形成植株的快速繁殖可以提高植物产量，改善植物品质，使优良品种迅速推广种植，为持续开发利用植物打下科学基础。皂苷主要分布于陆地高等植物中，也少量存在于海星和海参等海洋生物中。许多中草药如人参、远志、桔梗、甘草、知母和柴胡等的主要有效成分都含有皂苷。有些皂苷还具有抗菌的活性或解热、镇静、抗癌等有价值的生物活性。黄花倒水莲植株富含皂苷类物质，能对免疫功能产生影响，具有抗应激、抗炎、活血、调脂、对乙肝病毒体外抑制等作用。利用植物细胞、组织或器官培养来获取对人类有用的此生代谢产物是植物生物
的研究热点，其最大优点是完全可以在人工控制条件下进行，不受地理环境和季节等诸多因素的限制，可以通过改变培养条件和选择优良培养体系得到超整株植物收率的代谢产物。利用植物细胞或愈伤组织的大量培养生产黄花倒水莲次生代谢产物，可以工业化的生产黄花倒水莲皂苷类化合物，因此，提供一种通过培养黄花倒水莲愈伤组织或悬浮细胞的方法对于远志皂苷备制新途径的开发有着重要的意义。
技术实现思路
针对现有技术的上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种黄花倒水莲细胞培养法制备皂苷类化合物的方法，制得的皂苷类化合物为可以供药用的皂苷类化合物，所以要解决的技术问题是利用黄花倒水莲的愈伤组织或悬浮细胞的培养技术，通过对黄花倒水莲愈伤组织的诱导、继代培养、悬浮细胞培养生产皂苷类化合物，该方法不受季节及生育期的限制，方便，易操作，稳定性强。为达到上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种黄花倒水莲细胞培养法制备皂苷类化合物的方法，包括以下步骤：（1）黄花倒水莲种子的获取；（2）黄花倒水莲种子的消毒及无菌苗的获得；（3）诱导黄花倒水莲愈伤组织形成；（4）将黄花倒水莲愈伤组织进行继代培养，获得疏松、稳定的愈伤组织；（5）将愈伤组织转移到液体培养基中进行振荡培养；（6）添加不同种类和不同浓度的诱导因子，筛选出高产细胞；（7）将高产悬浮细胞进行增殖培养；（8）愈伤组织或悬浮细胞的干燥和粉碎；（9）愈伤组织或悬浮细胞中总皂苷的萃取、纯化和测定。所述步骤（2）中黄花倒水莲无菌苗的获得包括以下步骤：用手术刀将果实切下，选取未开裂的果实，用酒精浸泡果实40-50秒，再用无菌水洗脱，随后转移至质量体积百分比浓度为0.1%升汞溶液中浸泡10-12分钟，并以无菌水洗涤，用无菌滤纸吸干水分，在无菌操作台上用无菌手术刀将果实的果皮去除，将种子剔除出来放在无菌滤纸上，再将种子的外种皮去掉，将未成熟的种子和成熟的种子分开，然后未成熟的种子接入MS+0.2-0.5mg·L-1苄氨基嘌呤+蔗糖30g·L-1+琼脂5.5g·L-1的培养基中，成熟的种子接入MS培养基中，pH为5.8-6.0，置于12hd-1光周期、光照50μmolm-2s-1、温度25±1℃的培养室中培养，成熟种子10天左右开始萌发，胚轴和胚根长出，30天左右后种苗长大，未成熟种子7天左右形成不定芽，20天左右长出不定芽丛，繁殖系数约为8-10。黄花倒水莲愈伤组织的培养和继代包括以下步骤：以所获无菌苗的嫩叶、胚轴、茎尖等器官为外植体，所述的愈伤组织是黄花倒水莲无菌苗各部位为外植体在诱导培养基上培养30天可得到愈伤组织，愈伤组织诱导的培养基为MS+1.0mg·L-12,4-二氯苯氧乙酸+0.1mg·L-1N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲+蔗糖30g·L-1+琼脂5.5g·L-1，pH为5.8-6.0，将所获得的愈伤组织用相同培养基上培养稳定后，平均3周继代一次，并继代培养4-6代，可获得浅黄、疏松的愈伤组织。黄花倒水莲细胞悬浮细胞培养包括以下步骤：将获得的愈伤组织接种于液体培养基的三角瓶中，培养基为：MS+0.5mg·L-12,4-二氯苯氧乙酸+0.1mg·L-1苄氨基嘌呤+蔗糖30g·L-1+琼脂5.5g·L-1，pH为5.8-6.0，液体培养基中加入诱导因子，诱导因子为30-60mg·L-1丙酮酸钠+10-50mg·L-1水杨酸+0.1-0.3mg·L-1茉莉酮酸甲酯，黑暗条件下振荡培养，3周继代一次，继代3-5次，得到液体悬浮培养细胞。培养条件为温度25±1℃，摇床的转速110-130转/分钟。黄花倒水莲悬浮细胞总皂苷分离和测定包括以下步骤：黄花倒水莲细胞悬浮培养后，在离心机中离心，过滤出培养液中的细胞，置于恒温烘箱中干燥至恒重后，用粉碎机打碎，放入圆底烧瓶中，加入石油醚，在70-80℃的恒温水浴中回流3-4h后过滤，在过滤所得沉淀中加入乙醇，并进行超声波提取，将提取液进行蒸发，蒸发所得沉淀用甲醇溶解后，用甲醇定容待测。黄花倒水莲悬浮细胞其总皂苷含量范围为0.72-0.9mg·g-1。本专利技术黄花倒水莲细胞培养法制备皂苷类化合物的方法的有益效果如下：本专利技术利用组织及细胞培养生产含有较高皂苷化合物的黄花倒水莲愈伤组织和悬浮细胞，不仅可以节约土地、人力资源，保护生态环境，而且不受季节等外界因素的限制，可以源源不断的提供远志皂苷类化合物药源。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明，但本专利技术的保护范围并不限于此。实施例11、黄花倒水莲无菌苗的获得黄花倒水莲种子采集时间为9月份，选择晴朗的上午采集整个果序，用手术刀将果实切下，选取未开裂的果实，用70%的酒精浸泡果实40-50秒，再用无菌水洗脱2次，随后转移至质量体积百分比浓度为0.1%升汞溶液中浸泡10-12分钟，并以无菌水洗涤5次，用无菌滤纸吸干水分，在无菌操作台上用无菌手术刀将果实的果皮去除，将种子剔除出来放在无菌滤纸上，再将种子的外种皮去掉，将未成熟的种子和成熟的种子分开，然后未成熟的种子接入MS+0.2mg·L-1BAP（苄氨基嘌呤）+蔗糖30g·L-1+琼脂5.5g·L-1的培养基中，成熟的种子接入MS培养基中，pH为5.8-6.0。置于12hd-1光周期、光照50μmolm-2s-1、温度25±1℃的培养室中培养，成熟种子10天左右开始萌发，胚轴和胚根长出，30天左右后种苗长大，未成熟种子7天左右形成不定芽，20天左右长出不定芽丛，繁殖系数约为10。2、黄花倒水莲愈伤组织的培本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种黄花倒水莲细胞培养法制备皂苷类化合物的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）黄花倒水莲种子的获取；（2）黄花倒水莲种子的消毒及无菌苗的获得；（3）诱导黄花倒水莲愈伤组织形成；（4）将黄花倒水莲愈伤组织进行继代培养，获得疏松、稳定的愈伤组织；（5）将愈伤组织转移到液体培养基中进行振荡培养；（6）添加不同种类和不同浓度的诱导因子，筛选出高产细胞；（7）将高产悬浮细胞进行增殖培养；（8）愈伤组织或悬浮细胞的干燥和粉碎；（9）愈伤组织或悬浮细胞中总皂苷的萃取、纯化和测定。
【技术特征摘要】
1.一种黄花倒水莲细胞培养法制备皂苷类化合物的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）黄花倒水莲种子的获取；（2）黄花倒水莲种子的消毒及无菌苗的获得；（3）诱导黄花倒水莲愈伤组织形成；（4）将黄花倒水莲愈伤组织进行继代培养，获得疏松、稳定的愈伤组织；（5）将愈伤组织转移到液体培养基中进行振荡培养；（6）添加不同种类和不同浓度的诱导因子，筛选出高产细胞；（7）将高产悬浮细胞进行增殖培养；（8）愈伤组织或悬浮细胞的干燥和粉碎；（9）愈伤组织或悬浮细胞中总皂苷的萃取、纯化和测定。2.如权利要求1所述黄花倒水莲细胞培养法制备皂苷类化合物的方法，其特征在于所述步骤（2）中黄花倒水莲无菌苗的获得包括以下步骤：用手术刀将果实切下，选取未开裂的果实，用酒精浸泡果实40-50秒，再用无菌水洗脱，随后转移至质量体积百分比浓度为0.1%升汞溶液中浸泡10-12分钟，并以无菌水洗涤，用无菌滤纸吸干水分，在无菌操作台上用无菌手术刀将果实的果皮去除，将种子剔除出来放在无菌滤纸上，再将种子的外种皮去掉，将未成熟的种子和成熟的种子分开，然后未成熟的种子接入MS+0.2-0.5mg·L-1苄氨基嘌呤+蔗糖30g·L-1+琼脂5.5g·L-1的培养基中，成熟的种子接入MS培养基中，pH为5.8-6.0，置于12hd-1光周期、光照50μmolm-2s-1、温度25±1℃的培养室中培养，成熟种子10天左右开始萌发，胚轴和胚根长出，30天左右后种苗长大，未成熟种子7天左右形成不定芽，20天左右长出不定芽丛，繁殖系数约为8-10。3.如权利要求1所述黄花倒水莲细胞培养法制备皂苷类化合物的方法，其特征在于黄花倒水莲愈伤组织的诱导和继代包括以下步骤：以所获无菌苗的嫩叶、胚轴、茎尖等器官为外植体或以不定芽为外植体，所述的愈伤组织是黄花倒水莲无菌苗各部位为外植体...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗洁，杨国，莫亿伟，金叶飞，
申请(专利权)人：绍兴文理学院元培学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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