获得和校正生物序列信息的方法技术

本公开提供了用于对生物分子如核酸分子进行测序的方法，以及用于检测和/或校正测序结果中测序错误的方法。并提供了基于本文所公开方法的试剂盒和系统。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】获得和校正生物序列信息的方法
本专利技术在一些方面涉及一种高通量测序方法，属于基因测序领域。
技术介绍
高通量测序仪是近几年高速发展的技术。相较于传统桑格测序(Sangersequencing)，高通量测序最大的优势是可以同时读出海量的序列信息。虽然准确性不如传统测序方法，但由于海量数据分析，便可得出超出序列本身的信息，如基因表达量、拷贝数变化。当今主流测序仪均使用SBS(边合成边测序)方法，如Solexa/Illumina、454、IonTorrent等。这些测序仪的结构相似，都包括流体系统、光学系统和芯片系统。测序反应在芯片内发生。测序过程也很类似，都包括：将反应液通入芯片，发生SBS反应，采集信号，洗涤。接下来，进行新的一轮测序。这是一个循环过程。随着循环的增多，测出连续的单碱基非兼并序列信息(如ACTGACTG)。然而，高通量测序仪无法彻底消除测序错误。测序错误可能来源于：反应偶然错误或累积错误、信号采集错误、信号校正带来的误差等等。现有测序仪中，这些化学或光学、软件上的错误可成为噪声，在单个读出位点无法被识别，只能通过深度测序，利用同一序列在不同位点的多次读出进行消除。更准确的读出是高通量测序发展的重要方向。然而，现有技术对准确性的优化多集中在优化化学反应本身以及后续图像信号处理上，没有从测序逻辑上进行革新。因此存在改进的测序方法的需要。
技术实现思路
本申请要求以下中国专利申请的优先权：2015年11月18日提交的申请号为CN201510822361.9、标题为“一种磷酸修饰荧光团的核苷酸分子测序方法”的中国专利申请、2015年11月18日提交的申请号为CN201510815685.X、标题为“利用具有荧光切换性质荧光团的核苷酸底物分子进行测序的方法”的中国专利申请、2015年12月11日提交的申请号为CN201510944878.5、标题为“测序结果中序列数据错误的检测和校正方法”的中国专利申请以及2016年10月14日提交的申请号为CN201610899880.X、标题为“一种从高通量DNA测序的原始信号中读取序列信息的方法”的中国专利申请，所述中国专利申请的全部内容均通过引用整体并入本文。
技术实现思路
并非意图用于限制所要求保护的主题的范围。所要求保护的主题的其他特征、细节、效用和优点将从包括在附图和所附权利要求中公开的那些方面的详细描述中显现。一方面，本文提供了用于获得目标多核苷酸的序列信息的方法，该方法包括：a)在第一多核苷酸复制催化剂存在下向目标多核苷酸提供第一测序试剂，其中第一测序试剂包含各自缀合于第一标记的至少两种不同的核苷酸单体，并且核苷酸单体/第一标记缀合物直到根据与目标多核苷酸的互补性将核苷酸单体掺入目标多核苷酸之后基本上是非荧光的，其中至少两种不同的核苷酸单体的第一标记相同或不同；和b)在第二多核苷酸复制催化剂存在下向目标多核苷酸提供第二测序试剂，其中第二测序试剂包含各自缀合于第二标记的一种或多种核苷酸单体，并且核苷酸单体/第二标记缀合物直到根据与目标多核苷酸的互补性将核苷酸单体掺入目标多核苷酸之后基本上是非荧光的，一种或多种核苷酸单体中的至少一种不同于第一测序试剂中存在的核苷酸单体，并且其中第二测序试剂是在提供了第一测序试剂随后提供的，和c)通过在步骤a)和b)中将核苷酸单体掺入多核苷酸之后检测第一标记和第二标记导致的荧光发射，获得至少部分目标多核苷酸的序列信息。在一个实施方案中，方法用于获得至少部分单个目标多核苷酸的序列信息。在另一实施方案中，方法用于同时获得至少部分多个目标多核苷酸的序列信息。在任何前述实施方案中，第一多核苷酸复制催化剂和第二多核苷酸复制催化剂可以是相同的多核苷酸复制催化剂或不同的多核苷酸复制催化剂。在任何前述实施方案中，可通过一次或多次测序反应获得所述序列信息，其中可选地一次或多次测序反应在一个或多个反应体积(例如反应室)，例如约1×106至约5×108个反应体积、约1×106至约1×108个反应体积或约1×106至约5×107个反应体积中进行，其中任选地反应体积彼此物理分开和/或反应体积之间没有或基本上没有物料交换，其中可选地反应体积位于阵列如芯片中，其中任选地反应体积是封闭的和/或由与反应体积中的液体不互溶的液体例如油彼此隔离。当反应体积之间基本上没有物料交换时，允许有一些物料交换但这不会影响任何反应体积中的测序结果以导致交叉污染。在任何前述实施方案中，可在反应室中提供反应体积，并且每个反应室中的目标多核苷酸固定化于反应室中的固体载体上，其中任选地序列信息通过高通量测序获得，例如，其中至少约103、104、105、106、107、108或109条序列并行读取。在任何前述实施方案中，第一多核苷酸复制催化剂和/或第二多核苷酸复制催化剂为聚合酶，例如DNA聚合酶、RNA聚合酶或RNA依赖性RNA聚合酶、连接酶、逆转录酶或末端脱氧核糖核苷转移酶。在任何前述实施方案中，第一和/或第二测序试剂中的核苷酸单体可选自由以下组成的组：脱氧核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、肽核苷酸、修饰的肽核苷酸、修饰的磷酸糖主链核苷酸及其混合物。在一个实施方案中，第一测序试剂和第二测序试剂中的核苷酸单体均为脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，核苷酸单体选自由以下组成的组：A、T/U、C和G脱氧核糖核苷酸，及其类似物。在另一实施方案中，第一测序试剂和第二测序试剂中的核苷酸单体均为核糖核苷酸。在具体实施方案中，核苷酸单体选自由以下组成的组：A、U/T、C和G核糖核苷酸，及其类似物。在任何前述实施方案中，第一和/或第二标记可释放地缀合于核苷酸单体。在一个实施方案中，第一和/或第二标记缀合于核苷酸单体的末端磷酸基团。在具体实施方案中，第一测序试剂中的核苷酸单体/第一标记缀合物和/或第二测序试剂中的一种或多种核苷酸单体/第二标记缀合物具有以下式I的结构：其中n为0-6，R为核苷碱基，X为H、OH或OMe，或其盐。在一些实施方案中，第一和/或第二标记直到从核苷酸单体的末端磷酸基团释放之后基本上是非荧光的。在一个其他实施方案中，方法还包括利用活化酶从核苷酸单体的末端磷酸基团释放第一和/或第二标记。在一个实施方案中，活化酶是外切核酸酶、磷酸转移酶或磷酸酶。在任何前述实施方案中，第一测序试剂中的核苷酸单体/第一标记缀合物和/或第二测序试剂中的一种或多种核苷酸单体/第二标记缀合物可具有以下式II的结构：在任何前述实施方案中，至少两种不同的核苷酸单体的第一标记可以相同或彼此不同。在任何前述实施方案中，方法还可包括步骤a)和b)之间的洗涤步骤。在任何前述实施方案中，目标多核苷酸固定化于表面，例如固体表面、柔软表面、水凝胶表面、微粒表面或其组合上。在一个实施方案中，固体表面是微反应器的一部分，并且步骤a)和b)在微反应器中进行。在任何前述实施方案中，方法在约20℃至约70℃范围内的温度下进行。在任何前述实施方案中，可使用第一测序试剂和第二测序试剂的不同组合进行多轮步骤a)和b)。在任何前述实施方案中，步骤c)中获得的序列信息可以是简并序列。在一个实施方案中，使用与之前一轮或多轮步骤a)和b)中第一测序试剂和第二测序试剂的组合不同的第一测序试剂和第二测序试剂的组合进行至少本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于获得目标多核苷酸的序列信息的方法，所述方法包括：a)在第一多核苷酸复制催化剂存在下向目标多核苷酸提供第一测序试剂，其中所述第一测序试剂包含各自缀合于第一标记的至少两种不同的核苷酸单体，并且所述核苷酸单体/第一标记缀合物直到根据与所述目标多核苷酸的互补性将所述核苷酸单体掺入所述目标多核苷酸之后基本上是非荧光的，其中所述至少两种不同的核苷酸单体的所述第一标记相同或不同；和b)在第二多核苷酸复制催化剂存在下向所述目标多核苷酸提供第二测序试剂，其中所述第二测序试剂包含各自缀合于第二标记的一种或多种核苷酸单体，并且所述核苷酸单体/第二标记缀合物直到根据与所述目标多核苷酸的互补性将所述核苷酸单体掺入所述目标多核苷酸之后基本上是非荧光的，所述一种或多种核苷酸单体中的至少一种不同于所述第一测序试剂中存在的所述核苷酸单体，并且其中所述第二测序试剂是在提供了所述第一测序试剂随后提供的，和c)通过在所述步骤a)和b)中将所述核苷酸单体掺入所述多核苷酸之后检测所述第一标记和第二标记导致的荧光发射，获得至少部分所述目标多核苷酸的序列信息。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.19 CN 2015108223619;2015.11.19 CN 201510811.一种用于获得目标多核苷酸的序列信息的方法，所述方法包括：a)在第一多核苷酸复制催化剂存在下向目标多核苷酸提供第一测序试剂，其中所述第一测序试剂包含各自缀合于第一标记的至少两种不同的核苷酸单体，并且所述核苷酸单体/第一标记缀合物直到根据与所述目标多核苷酸的互补性将所述核苷酸单体掺入所述目标多核苷酸之后基本上是非荧光的，其中所述至少两种不同的核苷酸单体的所述第一标记相同或不同；和b)在第二多核苷酸复制催化剂存在下向所述目标多核苷酸提供第二测序试剂，其中所述第二测序试剂包含各自缀合于第二标记的一种或多种核苷酸单体，并且所述核苷酸单体/第二标记缀合物直到根据与所述目标多核苷酸的互补性将所述核苷酸单体掺入所述目标多核苷酸之后基本上是非荧光的，所述一种或多种核苷酸单体中的至少一种不同于所述第一测序试剂中存在的所述核苷酸单体，并且其中所述第二测序试剂是在提供了所述第一测序试剂随后提供的，和c)通过在所述步骤a)和b)中将所述核苷酸单体掺入所述多核苷酸之后检测所述第一标记和第二标记导致的荧光发射，获得至少部分所述目标多核苷酸的序列信息。2.根据权利要求1所述的方法，其用于获得至少部分单个目标多核苷酸的序列信息，或用于同时获得至少部分多种目标多核苷酸的序列信息。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一多核苷酸复制催化剂和所述第二多核苷酸复制催化剂是相同的多核苷酸复制催化剂，或其中所述第一多核苷酸复制催化剂和所述第二多核苷酸复制催化剂是不同的多核苷酸复制催化剂。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中通过一次或多次测序反应获得所述序列信息，其中可选地，所述一次或多次测序反应在一个或多个反应体积(例如反应室)中进行，例如约1×106至约5×108个反应体积、约1×106至约1×108个反应体积或约1×106至约5×107个反应体积，其中任选地，所述反应体积彼此物理分开和/或所述反应体积之间基本上没有物料交换，其中可选地所述反应体积位于阵列如芯片中，并且其中任选地，所述反应体积是封闭的和/或由与所述反应体积中的液体不互溶的液体例如油彼此隔离。5.根据权利要求4所述的方法，其中在反应室中提供所述反应体积，并且每个所述反应室中的所述目标多核苷酸被固定化于所述反应室中的固体载体上，其中任选地所述序列信息通过高通量测序获得，例如，其中至少约103、104、105、106、107、108或109条序列基本上并行读取。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述第一多核苷酸复制催化剂和/或所述第二多核苷酸复制催化剂为聚合酶，例如DNA聚合酶、RNA聚合酶或RNA依赖性RNA聚合酶、连接酶、逆转录酶或末端脱氧核糖核苷转移酶。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述第一和/或所述第二测序试剂中的所述核苷酸单体选自由以下组成的组：脱氧核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、肽核苷酸、修饰的肽核苷酸、修饰的磷酸糖主链核苷酸及其混合物。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述第一测序试剂和所述第二测序试剂中的所述核苷酸单体均为脱氧核糖核苷酸。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述核苷酸单体选自由以下组成的组：A、T/U、C和G脱氧核糖核苷酸，及其类似物。10.根据权利要求7所述的方法，其中所述第一测序试剂和所述第二测序试剂中的所述核苷酸单体均为核糖核苷酸。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述核苷酸单体选自由以下组成的组：A、U/T、C和G核糖核苷酸，及其类似物。12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述第一和/或所述第二标记可释放地缀合于所述核苷酸单体。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述第一和/或所述第二标记缀合于所述核苷酸单体的末端磷酸基团，或缀合于所述核苷酸单体的最后一个、倒数第二个、倒数第三个、倒数第四个或倒数第五个磷酸基团。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第一测序试剂中的所述核苷酸单体/第一标记缀合物和/或所述第二测序试剂中的所述一种或多种核苷酸单体/第二标记缀合物具有以下式I的结构：其中n为0-6，R为核苷碱基，X为H、OH或OMe，或其盐，其中任选地所述第一测序试剂中的所述核苷酸单体/第一标记缀合物和/或所述第二测序试剂中的所述一种或多种核苷酸单体/第二标记缀合物具有以下式II的结构：15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述第一和/或第二标记直到从所述核苷酸单体的所述末端磷酸基团释放之后基本上是非荧光的。16.根据权利要求15所述的方法，其还包括利用活化酶从所述核苷酸单体的所述末端磷酸基团释放所述第一和/或第二标记。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述活化酶是外切核酸酶、磷酸转移酶或磷酸酶。18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述至少两种不同核苷酸单体的所述第一标记相同。19.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述至少两种不同核苷酸单体的所述第一标记不同。20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其还包括在步骤a)和b)之间的清洗步骤。21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述目标多核苷酸被固定化于表面上，例如固体表面、柔软表面、水凝胶表面、微粒表面或其组合。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述固体表面是微反应器的一部分，并且步骤a)和b)在所述微反应器中进行。23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其在约20℃至约70℃范围内的温度下进行。24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中使用所述第一测序试剂和所述第二测序试剂的不同组合进行多轮步骤a)和b)。25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中步骤c)中获得的所述序列信息是简并序列。26.根据权利要求25所述的方法，其中使用与之前一轮或多轮步骤a)和b)中所述第一测序试剂和所述第二测序试剂的组合不同的所述第一测序试剂和所述第二测序试剂的组合进行至少另外一轮的步骤a)和b)，以获得至少一条附加序列，并且将所述附加序列与所述简并序列对比以获得非简并序列。27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中步骤c)中获得的所述初始序列信息不包含错误或者包含一个或多个错误。28.根据权利要求27所述的方法，其中使用与之前一轮或多轮步骤a)和b)中所述第一测序试剂和所述第二测序试剂的组合不同的所述第一测序试剂和所述第二测序试剂的组合进行至少另外一轮的步骤a)和b)，以获得至少一条附加序列，并且将所述附加序列与所述初始序列对比以减少或消除序列错误。29.根据权利要求26-28中任一项所述的方法，其中使用数学分析、算法或方法进行所述序列对比。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述数学分析、算法或方法包括马尔科夫模型或基于贝叶斯概型的最大似然法。31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述第一测序试剂包含两种不同的核苷酸单体/第一标记缀合物，每种核苷酸单体/第一标记缀合物包含不同的核苷酸单体，所述第二测序试剂包含两种不同的核苷酸单体/第二标记缀合物，每种核苷酸单体/第二标记缀合物包含不同的核苷酸单体，并且所述第一测序试剂中的两种核苷酸单体不同于所述第二测序试剂中的两种核苷酸单体。32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述第一测序试剂中的两种核苷酸单体和所述第二测序试剂中的两种核苷酸单体选自由以下组成的组：A、T/U、C和G脱氧核糖核苷酸，及其类似物。33.根据权利要求32所述的方法，其中所述第一测序试剂中的两种核苷酸单体和所述第二测序试剂中的两种核苷酸单体选自由以下组合组成的组：1)一种测序试剂中的A和T/U脱氧核糖核苷酸以及另一种测序试剂中的C和G脱氧核糖核苷酸；2)一种测序试剂中的A和G脱氧核糖核苷酸以及另一种测序试剂中的C和T/U脱氧核糖核苷酸；和3)一种测序试剂中的A和C脱氧核糖核苷酸以及另一种测序试剂中的G和T/U脱氧核糖核苷酸。34.根据权利要求33所述的方法，其中进行一轮步骤a)和b)或至少两轮步骤a)和b)，将所述组合1)-3)中的一个组合用于一轮步骤a)和b)，并将所述组合1)-3)中与前一轮步骤a)和b)中所用组合不同的另一个组合用于另一轮步骤a)和b)。35.根据权利要求34所述的方法，其中进行三轮步骤a)和b)，每轮使用选自所述组合1)-3)的不同组合。36.根据权利要求34或35所述的方法，其中对比从多轮步骤a)和b)获得的序列，以获得非简并序列和/或减少或消除所述非简并序列中的序列错误。37.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述第一测序试剂中的两种核苷酸单体和所述第二测序试剂中的两种核苷酸单体选自由以下组成的组：A、T/U、C和G核糖核苷酸，以及其类似物。38.根据权利要求37所述的方法，其中所述第一测序试剂中的两种核苷酸单体和所述第二测序试剂中的两种核苷酸单体选自由以下组合组成的组：1)一种测序试剂中的A和T/U核糖核苷酸以及另一种测序试剂中的C和G核糖核苷酸；2)一种测序试剂中的A和G核糖核苷酸以及另一种测序试剂中的C和T/U核糖核苷酸；和3)一种测序试剂中的A和C核糖核苷酸以及另一种测序试剂中的G和T/U核糖核苷酸。39.根据权利要求38所述的方法，其中进行一轮步骤a)和b)或至少两轮步骤a)和b)，将所述组合1)-3)中的一个组合用于一轮步骤a)和b)，并将所述组合1)-3)中与前一轮步骤a)和b)中所用组合不同的另一个组合用于另一轮步骤a)和b)。40.根据权利要求39所述的方法，其中进行至少三轮步骤a)和b)，每轮使用所述组合1)-3)中的不同组合。41.根据权利要求39或40所述的方法，其中对比从多轮步骤a)和b)获得的序列，以获得非简并序列和/或减少或消除所述非简并序列中的序列错误。42.根据权利要求31-41中任一项所述的方法，其中所述两种不同核苷酸单体的所述第一标记相同，并且所述第二标记与所述第一标记相同。43.根据权利要求31-41中任一项所述的方法，其中所述两种不同核苷酸单体的所述第一标记不同，并且所述第二标记与所述第一标记相同。44.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述第一和第二测序试剂中的一种包含三种不同的核苷酸单体/第一标记缀合物，每种核苷酸单体/第一标记缀合物包含不同的核苷酸单体，另一种测序试剂包含一种核苷酸单体/第二标记缀合物，并且一种测序试剂中的三种核苷酸单体不同于另一种测序试剂中的核苷酸单体。45.根据权利要求44所述的方法，其中所述第一测序和所述第二测序试剂中的所述核苷酸单体选自由以下组成的组：A、T/U、C和G脱氧核糖核苷酸，以及其类似物。46.根据权利要求45所述的方法，其中所述第一和第二测序试剂中的所述核苷酸单体选自由以下组合组成的组：1)一种测序试剂中的C、G和T/U脱氧核糖核苷酸以及另一种测序试剂中的A脱氧核糖核苷酸；2)一种测序试剂中的A、G和T/U脱氧核糖核苷酸以及另一种测序试剂中的C脱氧核糖核苷酸；3)一种测序试剂中的A、C和T/U脱氧核糖核苷酸以及另一种测序试剂中的G脱氧核糖核苷酸；和4)一种测序试剂中的A、C和G脱氧核糖核苷酸以及另一种测序试剂中的T/U脱氧核糖核苷酸。47.根据权利要求46所述的方法，其中进行一轮步骤a)和b)或至少两轮步骤a)和b)，将所述组合1)-4)中的一个组合用于一轮步骤a)和b)，并将所述组合1)-4)中与前一轮步骤a)和b)中所用组合不同的另一个组合用于另一轮步骤a)和b)。48.根据权利要求46所述的方法，其中进行三轮步骤a)和b)，每轮使用选自所述组合1)-4)的不同组合。49.根据权利要求46所述的方法，其中进行四轮步骤a)和b)，每轮使用选自所述组合1)-4)的不同组合。50.根据权利要求47-49中任一项所述的方法，其中对比从多轮步骤a)和b)获得的序列，以获得非简并序列和/或减少或消除所述非简并序列中的序列错误。51.根据权利要求44所述的方法，其中所述第一测序和所述第二测序试剂中的所述核苷酸单体选自由以下组成的组：A、T/U、C和G核糖核苷酸，以及其类似物。52.根据权利要求51所述的方法，其中所述第一和第二测序试剂中的所述核苷酸单体选自由以下组合组成的组：1)一种测序试剂中的C、G和T/U核糖核苷酸以及另一种测序试剂中的A核糖核苷酸；2)一种测序试剂中的A、G和T/U核糖核苷酸以及另一种测序试剂中的C核糖核苷酸；3)一种测序试剂中的A、C和T/U核糖核苷酸以及另一种测序试剂中的G核糖核苷酸；和4)一种测序试剂中的A、C和G核糖核苷酸以及另一种测序试剂中的T/U核糖核苷酸。53.根据权利要求52所述的方法，其中进行一轮步骤a)和b)或至少两轮步骤a)和b)，将所述组合1)-4)中的一个组合用于一轮步骤a)和b)，并将所述组合1)-4)中与前一轮步骤a)和b)中所用组合不同的另一个组合用于另一轮步骤a)和b)。54.根据权利要求52所述的方法，其中进行至少三轮步骤a)和b)，每轮使用所述组合1)-4)中的不同组合。55.根据权利要求52所述的方法，其中进行至少四轮步骤a)和b)，每轮使用所述组合1)-4)中的不同组合。56.根据权利要求52-55中任一项所述的方法，其中对比从多轮步骤a)和b)获得的序列，以获得非简并序列和/或减少或消除所述非简并序列中的序列错误。57.根据权利要求1-56中任一项所述的方法，其中获得约250、约350、约400、约500、约800或约2400个碱基对的读长。58.根据权利要求1-57中任一项所述的方法，其中获得至少约95％的代码准确率。59.根据权利要求1-58中任一项所述的方法，其中所述目标多核苷酸是单链多核苷酸。60.一种用于获得目标多核苷酸的序列信息的方法，所述方法包括：a)在第一多核苷酸复制催化剂存在下向目标多核苷酸提供第一测序试剂，其中所述第一测序试剂包含各自缀合于第一标记的两种不同的核苷酸单体，并且所述核苷酸单体/第一标记缀合物直到根据与所述目标多核苷酸的互补性将所述核苷酸单体掺入所述目标多核苷酸之后基本上是非荧光的；和b)在第二多核苷酸复制催化剂存在下向所述目标多核苷酸提供第二测序试剂，其中所述第二测序试剂包含各自缀合于第二标记的两种不同的核苷酸单体，并且所述核苷酸单体/第二标记缀合物直到根据与所述目标多核苷酸的互补性将所述核苷酸单体掺入所述目标多核苷酸之后基本上是非荧光的，并且其中所述第二测序试剂是在提供了所述第一测序试剂随后提供的，和c)通过在所述步骤a)和b)中将所述核苷酸单体掺入所述多核苷酸之后检测所述第一标记和第二标记导致的荧光发射，获得至少部分所述目标多核苷酸的序列信息，其中所述第一测序试剂和所述第二测序试剂中的所述核苷酸单体选自由以下组合组成的组：1)一种测序试剂中的腺嘌呤(A)核苷酸单体和胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)核苷酸单体以及另一种测序试剂中的胞嘧啶(C)核苷酸单体和鸟嘌呤(G)核苷酸单体；2)一种测序试剂中的腺嘌呤(A)核苷酸单体和鸟嘌呤(G)核苷酸单体以及另一种测序试剂中的胞嘧啶(C)核苷酸单体和胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)核苷酸单体；和3)一种测序试剂中的腺嘌呤(A)核苷酸单体和胞嘧啶(C)核苷酸单体以及另一种测序试剂中的鸟嘌呤(G)核苷酸单体和胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)核苷酸单体。61.根据权利要求60所述的方法，其中步骤a)中所述两种不同核苷酸单体的所述第一标记以及步骤b)中所述两种不同核苷酸单体的所述第二标记是相同标记。62.根据权利要求60所述的方法，其中所述第一标记包括两个不同的标记，并且其中所述第一标记中的一个与所述第二标记中的一个相同，而所述第一标记中的另一个与所述第二标记中的另一个相同。63.根据权利要求60-62中任一项所述的方法，其中进行多轮步骤a)和b)，每轮使用选自所述组合1)-3)的组合。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄岩谊，陈子天，周文雄，段海峰，康力，乔朔，
申请(专利权)人：北京大学，赛纳生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11