改进的新一代测序制造技术

本发明专利技术能够在仅仅一轮PCR扩增和随后的片段化之后，通过和所谓的新一代测序之后，通过以下方法通过NGS确定一个或多个长度大于大约800bp的目标多核苷酸的全核苷酸序列：在每种多核苷酸的至少一个末端加上至少一种已知的寡核苷酸标记，产生延长的多核苷酸，其中加在每种多核苷酸上的每种已知的寡核苷酸标记是独特的；将延长的多核苷酸片段化；使用桥式扩增和新一代测序通过成对的正向和反向读出对获得的片段进行测序；基于已知的寡核苷酸对成对的正向和反向序列读出进行分类；和对分类的成对序列进行人工或计算机模拟组装，从而提供多种多核苷酸中每一种的全编码序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改进的新一代测序序列表参考本申请含有计算机可读形式的序列表。在此将计算机可读形式并入作为参考。专利
本专利技术使得在仅仅一轮PCR扩增、随后的片段化(fragmentation)和所谓的新一代测序之后能够确定长度大于大约500bp的一个或多个目标多核苷酸的全核苷酸序列。
技术介绍
DNA测序仪(Inc.USA)的出现使得能够进行所谓的“新一代测序”(NGS)，其能够由单一读出(singleread)实现大约300个核苷酸的连续测序读出，或者使用具有50-100个核苷酸的重叠以保证两个读出(read)正确合并的正向读出(大约300个核苷酸)和反向读出(大约250个核苷酸)实现大约500个核苷酸的连续测序读出。为了用NGS对更长的多核苷酸进行测序，通常将DNA片段化，然后分离出大小适宜的片段(<500核苷酸)，将接头-(adaptor-)或标记-(index-)寡核苷酸连接在DNA片段上。接头(adaptor)可以带有独特的(unique)核苷酸序列——一种可以用于在混合样品的片段之间进行区分的标记(index)。接头还具有用于使NGS测序仪的流动池退火的特定DNA序列。将这些接头与片段连接要求加入用于DNA提纯的酶和磁珠。加入接头多多少少要耗时，并且当然地增加了较长序列NGS过程的成本。Novozymes例行制造上千种新的不同的酶编码基因，需要确定或验证这些基因的核苷酸序列。酶编码基因长度通常为800-3000bp。需要有可以迅速、低成本地提供上千种大小范围为800-3,000bp的酶编码基因或基因变体的全序列的测序方法。
技术实现思路
本专利技术能够在仅仅一轮PCR扩增和随后的片段化(fragmentation)之后，通过NGS确定长度大于大约800bp的一个或多个目标多核苷酸的全核苷酸序列。PCR反应可以在包括目标多核苷酸的培养细胞、这些细胞的孢子或者包括目标多核苷酸的其他材料上直接进行。将独特的标记寡核苷酸引入到每个变体的PCR扩增中，例如，在PCR反应的正向引物上。PCR反应平行进行，产生的PCR产物混合(合并)在一起。然后将含有来自不同变体的DNA的该PCR产物混合物片段化，理想地使用随机片段化，以在每个基因变体上得到一个随机定位的切割。接下来，例如，通过从琼脂糖凝胶上切割片段，分离出大小超过NGS500bp测序限制的DNA片段。然后，向分离出的片段混合物中加入含有另一标记的测序接头寡核苷酸，使得该目标样品可以与其他DNA测序样品在同一NGS运行中一起多重进行(multiplex)。在测序运行之后，将样品得到的所有成对序列读出经由首次PCR过程中加入的标记序列分解(demultiplex)。这样做使得如果在一个读出上发现标记，如独特的标记所示将相应的配对读出分类至相同来源的基因变体(或微量滴定板中的位置)。当独特标记得到的所有读出针对参考序列定位/对比或者从头组装之后，可以得到长度大于800bp的序列。具有单个标记引物的方法的示意图参见图1，具有两个标记引物的方法的示意图参见图2。例如，随机片段化可以通过使用所谓的片段化酶(fragmentase)或一种或多种限制性内切酶或者通过物理剪切进行。片段化酶是用于核酸的随机片段化的酶或酶混合物。它可以由两种酶组成，其中一种在双链DNA上随机产生缺口，另一种识别缺口位点，并切割缺口对边相对的DNA链，导致双链DNA的断裂。另外可选地，片段化酶系统可以使用依赖于修饰的核酸内切酶，其要求在之前的PCR步骤中引入修饰的碱基。片段化产生不同长度的DNA片段，但仅有仍具有开始时的标记的DNA片段将被退火至NGS流动池。因此，标记得到的所有读出总是处于PCR产物的开始。每个这些分类的读出还具有来自NGS测序过程的配对读出。配对读出在DNA片段的另一端开始。由于片段化之后DNA片段大小的变化，其位置在片段之间有变化。靠近起始标记的测序覆盖度(coverage)将总是远高于其中仅有配对读出有贡献的朝向PCR产物另一端的覆盖度。该方法仅有的限制是可以产生配对读出的DNA的长度。Inc.目前指出，可以在其机器的流动池上有效的桥式扩增(bridge-amplified)的最大DNA长度为1kb。在方法中，在测序之前，使用桥式PCR或聚簇PCR在测序芯片上扩增克隆序列。将侧面连接有接头的DNA文库的单个分子在芯片上用密集覆盖测序芯片表面的引物进行扩增。这导致了紧密束缚(tethered)且局部含有的克隆PCR产物，其可以在基于荧光的可逆终止测序过程中给出良好的信号。这被称作是桥式扩增，因为在扩增一条链之后，DNA需要架桥(bridgeover)，使得DNA的另一端与芯片上的另一引物解除，以开始反向链的扩增。使用PCR产物开始时的正向标记和PCR结束时的反向标记，使可能的测序长度翻番，使得可以对1600bp以上进行测序。该方法的优势在于，对于每个变体，单个独立PCR反应的平行制备很容易，例如，在96孔或384孔PCR仪器中。每个变体使用两种标记的引物。这些引物很短，以两个碱基开始，有长度为8个碱基的标记序列和18-22个碱基的退火区。PCR反应可以非常低的体积进行(<5微升)，因为在将许多独立的样品集中之后，对后续的片段化和片段大小选择而言得到足够的起始材料。在此，例如，对于96或384孔样品，仅需要测序接头的再次连接。因此，在第一个方面，本专利技术提供用于确定多种多核苷酸的全编码序列的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供多种多核苷酸，b)在每种多核苷酸的至少一个末端加上至少一种已知的寡核苷酸标记(index)，产生延长的多核苷酸，其中加在每种多核苷酸上的每种已知的寡核苷酸标记是独特的；c)将延长的多核苷酸片段化；d)使用桥式扩增和新一代测序通过成对的正向和反向读出对获得的片段进行测序；e)基于至少一种已知的寡核苷酸标记对成对的正向和反向序列读出进行分类；和f)对分类的成对序列进行人工或生物信息学模拟(insilico)组装，从而提供多种多核苷酸中每一种的全编码序列。附图说明图1显示了本专利技术用一种标记引物进行测序的原理示意图。图2显示了本专利技术用两种标记引物进行测序的原理示意图。图3显示了两块琼脂糖凝胶电泳凝胶的照片：左图的凝胶显示了10或12分钟碎片化之后的2μgDNA。右图的凝胶显示在切除具有片段化DNA的琼脂糖之后的相同DNA。泳道1：DirectLoadTM宽范围DNA标记物(SigmaAldrich)，其显示长度为1500、1400、1000、750、500、400、300、200、100、50bp的DNA带。泳道2：10分钟片段化；提取大小范围800-1100bp的DNA(称作B2HDF)。泳道2：10分钟片段化；提取大小范围500-1300bp的DNA(称作B2HDG)。泳道3：10分钟片段化；提取大小范围100-1300bp的DNA(称作B2HDJ)。泳道4：12分钟片段化；提取大小范围800-1100bp的DNA(称作B2HDH)。泳道2：12分钟片段化；提取大小范围500-1300bp的DNA(称作B2HDK)。泳道3：12分钟片段化；提取大小范围100-1300bp的DNA(称作B2HDM)。图4显示了来自具有不同Savinase变体的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于确定多种多核苷酸的全编码序列的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供多种多核苷酸，b)在每个多核苷酸的至少一个末端加上至少一种已知的寡核苷酸标记，产生延长的多核苷酸，其中加在每个多核苷酸上的每个已知的寡核苷酸标记是独特的；c)将延长的多核苷酸片段化；d)使用桥式扩增和新一代测序通过成对的正向和反向读出对获得的片段进行测序；e)基于所述至少一种已知的寡核苷酸标记对成对的正向和反向序列读出进行分类；和f)对分类的成对序列进行人工或计算机模拟组装，从而提供每一个多种多核苷酸的全编码序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.02.23 US 62/298,8991.一种用于确定多种多核苷酸的全编码序列的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供多种多核苷酸，b)在每个多核苷酸的至少一个末端加上至少一种已知的寡核苷酸标记，产生延长的多核苷酸，其中加在每个多核苷酸上的每个已知的寡核苷酸标记是独特的；c)将延长的多核苷酸片段化；d)使用桥式扩增和新一代测序通过成对的正向和反向读出对获得的片段进行测序；e)基于所述至少一种已知的寡核苷酸标记对成对的正向和反向序列读出进行分类；和f)对分类的成对序列进行人工或计算机模拟组装，从而提供每一个多种多核苷酸的全编码序列。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多种多核苷酸编码一种或多种目标多肽。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述多种多核苷酸编码一种或多种目标多肽的变体。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述多种多核苷酸包括一个或多个启动子。5.根据权利要求2-3中任一项所述的方法，其中所述一种或多...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·纳尔逊，M·马尔滕，T·A·波尔森，M·巴吉森，P·拉迈亚，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK