一种用于兔源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种用于兔源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒，包括PCR反应液、酶混合液、兔源性NADH6基因标准品、阴性对照品和阳性对照品。本发明专利技术通过提取待检测样品的DNA结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测肉制品中兔源性含量的目的，具有快速、灵敏、特异性好的特点，对判断肉制品中兔源性含量具有重要意义。

A real-time quantitative PCR kit for rabbit origin detection

The invention relates to a real-time fluorescent quantitative PCR kit for rabbit-derived detection, which comprises a PCR reaction solution, an enzyme mixture, a rabbit-derived NADH6 gene standard, a negative reference and a positive reference. The method can accurately quantify the rabbit-derived content in meat products by extracting DNA from the samples to be tested and combining with real-time fluorescence quantitative PCR detection technology, and has the characteristics of fast, sensitive and good specificity, and is of great significance for judging the rabbit-derived content in meat products.

【技术实现步骤摘要】
一种用于兔源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒
本专利技术涉及食品检测
，尤其涉及一种用于兔源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒。
技术介绍
近些年，出现很多关于肉制品造假的新闻，肉制品的肉源已经引起大众的关注。比如给猪肉涂上牛肉膏冒充牛肉，劣质鸭肉冒充肥羊肉，甚至有些不法商贩用劣质猫狗肉冒充羊肉制成羊肉串等等。生活中关于肉制品的质量问题已经成为人们的心头大患。肉制品的肉质来源成分的检测涉及到很多行业，比如肉制品的进出口贸易，国内肉制品加工工业、餐饮业等等，范围非常广泛。目前，对肉制品动物源中兔源成分的检验亟需非常关键的检测技术。过去用于肉制食品中物种的鉴别主要依赖于电泳法、免疫法、ELISA等蛋白质分析法。这些技术对于加工混合肉制品却无法分析出，而PCR技术基于其反应时间短，具有较高灵敏性、特异性成为鉴别加工食品中物种的优先选择。但传统的PCR技术在定量和大批量检测中局限性较大。因此，急于发现一种新的技术可以精确地辨别物种并实现快速、大容量的实时定量检测。实时荧光定量PCR凭借其高灵敏度和特异性，可检测熟肉以及混合样本等特点，已逐步成为肉类成分鉴别的主流技术。近年来，国内外已有利用TaqMan探针法对不同肉类种属进行鉴别的报告。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏、特异性好的用于兔源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒。为解决上述问题，本专利技术所述的一种用于兔源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒，包括—PCR反应液，由12mMTris-HCl（pH8.9）、100mMKCl、0.12%TritonX-100、0.12%胆酸钠、0.6mg/mLBSA、1.8mMMgCl2、50nMdNTP、500nM上游引物、500nM下游引物、300nMTaqman探针组成；其中上游引物序列为5'-CGAGTAATCTCAATAACAA-3'；下游引物序列为5'-TTGTTGGGTTTTCTTCTAA-3'；探针序列为5’-CCCCTAAAACGAATATACC-3’；—酶混合液，由5U/µLTaqDNA聚合酶，50%甘油，20mMTris-HCl(pH8.0,25℃)，100mMKCl，0.1mMEDTA，1mMDTT，0.5%Tween®20和0.5%NP-40组成；—兔源性NADH6基因标准品，由1.00×107copies/ml、1.00×106copies/ml、1.00×105copies/ml、1.00×104copies/ml的重组质粒组成；其中NADH6基因标准品序列为5’-CCAAACCTACCTCTATTAACACCCCTAAAACGAATATACCCAAAATCATAACATTCGATCCTCAAGTCTCAGGATACTCCTCAGTTGCCATCGCAG-3’；—阴性对照品，由水组成；—阳性对照品，由1.00×107copies/ml的重组质粒组成。所述探针中5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。本专利技术与现有技术相比具有以下优点：1、本专利技术采用基因克隆技术，将兔源性DNA的NADH6基因种内保守片段插入到载体pMD18-T中，获得含有NADH6基因片段的重组质粒，以此作为标准品。根据兔源性NADH6的基因片段编码基因序列设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行评估。2、本专利技术通过提取待检测样品的DNA结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测肉制品中兔源性含量的目的，对判断肉制品中兔源性含量具有重要意义，必将在食品微生物检测领域发挥重要作用。3、本专利技术快速、灵敏、特异性好。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明。图1为本专利技术引物和探针体系优化实验结果。a代表引物为1.6ul，探针为1.6ul；b代表引物为1.0ul，探针为1.6ul；c代表引物为1.0ul，探针为0.8ul；d代表引物为2.0ul，探针为0.8ul；e代表引物为1.6ul，探针为0.8ul；f代表引物为2.0ul，探针为1.0ul；g代表引物为1.0ul，探针为0.8ul；h代表引物为1.0ul，探针为1.0ul；i代表引物为2.0ul，探针为1.6ul。图2为本专利技术灵敏度实验结果。a代表质粒浓度分别为1.00×107copies/ml、b代表质粒浓度为1.00×106copies/ml、c代表质粒浓度为1.00×105copies/ml、d代表质粒浓度为1.00×104copies/ml、e代表质粒浓度为1.00×103copies/ml、f代表质粒浓度为1.00×102copies/ml和阴性对照。图3为本专利技术特异性实验结果。其中出现标准扩增曲线的为兔，未出现标准扩增曲线的为牛、羊、猪、鱼、鸡、鸭、鹅、鼠、驴、蛙、狗、阴性对照。图4为本专利技术兔源性标准曲线。具体实施方式一种用于兔源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒，包括—PCR反应液，由12mMTris-HCl（pH8.9）、100mMKCl、0.12%TritonX-100、0.12%胆酸钠、0.6mg/mLBSA、1.8mMMgCl2、50nMdNTP、500nM上游引物、500nM下游引物、300nMTaqman探针组成；其中上游引物序列为5'-CGAGTAATCTCAATAACAA-3'；下游引物序列为5'-TTGTTGGGTTTTCTTCTAA-3'；探针序列为5’-CCCCTAAAACGAATATACC-3’；—酶混合液，由5U/µLTaqDNA聚合酶，50%甘油，20mMTris-HCl(pH8.0,25℃)，100mMKCl，0.1mMEDTA，1mMDTT，0.5%Tween®20和0.5%NP-40组成；—兔源性NADH6基因标准品，由1.00×107copies/ml、1.00×106copies/ml、1.00×105copies/ml、1.00×104copies/ml的重组质粒组成；其中NADH6基因标准品序列为5’-CCAAACCTACCTCTATTAACACCCCTAAAACGAATATACCCAAAATCATAACATTCGATCCTCAAGTCTCAGGATACTCCTCAGTTGCCATCGCAG-3’（SEQIDNO.2）；—阴性对照品，由水组成；—阳性对照品，由1.00×107copies/ml的重组质粒组成。其中：探针中5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。下述实验例中所用方法如无特殊说明均为常规方法，所用引物、探针和所用序列测定工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和完成。实例1NADH6基因标准品的制备要建立实时荧光定量PCR方法，首先必须制备方法所需的外部标准品，标准品应包含高度保守、特异的序列，要保证反应的高特异性。动物线粒体DNA具有分子量小、结构保守、热稳定性好、不易降解的结构特点和母系遗传、拷贝数多、进化速度快、不发生重组的遗传特点，其中线粒体NADH6基因序列最为保守型。NADH6基因检测兔源性，有较高的敏感性和特异性。本部分主要采用PCR技术扩增兔源性NADH6基因，利用基因重组技术将其连接到质粒载体pM本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于兔源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒，包括—PCR反应液，由12mM Tris‑HCl、100mM KCl、0.12%Triton X‑100、0.12% 胆酸钠、0.6 mg/mL BSA、1.8mM MgCl2、50nM dNTP、500nM 上游引物、500nM 下游引物、300nM Taqman探针组成；其中上游引物序列为5'‑ CGAGTAATCTCAATAACAA‑3'；下游引物序列为5'‑TTGTTGGGTTTTCTTCTAA‑3'；探针序列为5’‑CCCCTAAAACGAATATACC‑3’；—酶混合液，由5U/µL Taq DNA聚合酶，50%甘油，20mM Tris‑HCl，100mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5% Tween®20和0.5% NP‑40组成；—兔源性NADH6基因标准品，由1.00×107copies/ml、1.00×106copies/ml、1.00×105copies/ml、1.00×104copies/ml的重组质粒组成；其中NADH6基因标准品序列为5’‑CCAAACCTACCTCTATTAACACCCCTAAAACGAATATACCCAAAATCATAACATTCGATCCTCAAGTCTCAGGATACTCCTCAGTTGCCATCGCAG‑3’；—阴性对照品，由水组成；—阳性对照品，由1.00×107copies/ml的重组质粒组成。...

【技术特征摘要】
2017.12.01 CN 20171125137931.一种用于兔源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒，包括—PCR反应液，由12mMTris-HCl、100mMKCl、0.12%TritonX-100、0.12%胆酸钠、0.6mg/mLBSA、1.8mMMgCl2、50nMdNTP、500nM上游引物、500nM下游引物、300nMTaqman探针组成；其中上游引物序列为5'-CGAGTAATCTCAATAACAA-3'；下游引物序列为5'-TTGTTGGGTTTTCTTCTAA-3'；探针序列为5’-CCCCTAAAACGAATATACC-3’；—酶混合液，由5U/µLTaqDNA聚合酶，50%甘油，20mMTris-HCl，100mMKCl，0.1mMEDTA，1mM...

【专利技术属性】
技术研发人员：车团结，徐红，陈游，沈颂东，李亚鹏，
申请(专利权)人：苏州百源基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32