核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种核酸适配体‑分子印迹协同识别磁性微球及其制备方法和应用。本发明专利技术所述的核酸适配体‑分子印迹协同识别磁性微球，包括磁性微球内核和核酸适配体‑分子印迹协同识别外壳，所述核酸适配体‑分子印迹协同识别外壳具有分子印迹聚合物刚性识别空穴，该分子印迹聚合物刚性识别空穴结构稳定、不易变形，特异性吸附强，所述核酸适配体不易酶解。

Synergistic identification of magnetic microspheres by aptamer molecular imprinting and its preparation and Application

The invention discloses a nuclear acid aptamer molecularly imprinted synergistic recognition magnetic microsphere, a preparation method and application thereof. The nucleic acid aptamer molecular imprinting synergistic recognition magnetic microsphere comprises a magnetic microsphere inner core and a nucleic acid aptamer molecular imprinting synergistic recognition shell. The nucleic acid aptamer molecular imprinting synergistic recognition shell has a molecularly imprinted polymer rigid recognition hole, and the molecularly imprinted polymer rigid recognition hole. The aptamers are stable, not easy to deform, and strong in specific adsorption, and the aptamers are not easy to enzymolysis.

【技术实现步骤摘要】
核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球及其制备方法和应用
本专利技术属于化学分析测试
，涉及固相微萃取技术，尤其涉及核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球及其制备方法和应用。
技术介绍
样品前处理是样品分析的第一步，也是整个分析过程中的关键步骤，直接影响样品分析的准确度和精密度。样品前处理主要目的在于分离和富集样品中的待测组分，减小基体或杂质干扰，满足后续测试仪器对样品形态、浓度、洁净程度等的要求。传统样品前处理技术如液液萃取、溶剂提取、索氏提取、柱色谱等，普遍存在耗时、低效、有毒有机溶剂用量大或操作较繁琐等问题，导致样品前处理成为整个分析过程中最费时费力的环节，占样品分析时间的60％～70％，同时分析过程中产生的误差至少三分之一来自于样品前处理。因此，急需发展简单、快速、高效、绿色、自动化的样品前处理技术。对于复杂样品如血浆、尿液、动植物组织等而言，由于基体干扰的多样性和复杂性，痕量或超痕量待测组分的分离、富集更为需要的是高亲和力、高选择性的样品前处理技术。进入二十一世纪以来，日益突出的环境污染问题及民众对食品、药品安全意识的提高使仪器分析技术得到快速发展，仪器灵敏度大幅提高，对测试的样品提出了更高要求，因而样品前处理技术受到了越来越多的关注与重视。一些新的样品前处理技术如微波辅助萃取、加压溶剂萃取、超临界流体萃取、凝胶渗透色谱、吹扫捕集、膜分离、固相萃取、基质固相分散萃取、液相微萃取、固相微萃取等纷纷涌现。其中，固相微萃取由于集采样、萃取、浓缩及进样于一体，具有耗时少、操作简单、效率高、无溶剂或少溶剂、易与色谱仪器联用等优点，成为国内外样品前处理技术领域的研究热点，在环境、生物、食品及药物分析等领域中获得了广泛应用。传统固相微萃取技术采用石英纤维萃取头，操作简便，但石英纤维在使用过程中容易折断，且涂层体积及比表面积较小，使用寿命及萃取容量受到较大限制。为此，国内外研究者们开发了搅拌棒式、毛细管式及磁性微球式固相微萃取技术。其中，磁性微球固相微萃取技术通过在磁性纳米粒子表面包裹涂层材料，所制得的纳米、亚微米级微球具有比表面积大、萃取容量高等特性，且在磁场下可快速、定向分离，操作简便，受到普遍关注。选择性差是目前商品化固相萃取柱存在的主要问题，为了实现特异性吸附，相关研究者选择在吸附剂材料修饰选择性识别功能团如冠醚、杯芳烃、分子印迹聚合物、抗体等。其中具有选择性高、稳定性好、制备简单等特点的分子印迹聚合物(Molecularlyimprintedpolymer，MIP)成为固相微萃取涂层材料的研究热点。MIP由于具有类似于酶-底物的“钥匙-锁”相互作用识别原理，选择性有进一步提高。但由于分子印迹技术自身的特点，尚存在极性溶剂干扰、“刚性识别空穴”易被破坏或变形等不足，在生物样品(常以水溶液形式存在)分析中的应用受到较大限制。核酸适配体是通过指数富集配基的系统进化技术(SELEX)经体外筛选得到的一段短的单链寡核苷酸序列(DNA或RNA)，基于单链核酸结构和空间构象的多样性，适配体通过链内某些互补碱基间的配对和静电作用、氢键作用等自身发生适应性折叠形成稳定的三维结构，如发夹、假结、凸环、G2四分体等，通过空间构型互补与配体分子高亲和力、高特异性结合。高分辨三维结构研究发现，核酸适配体与配体能通过范德华力、氢键作用、静电作用及形状匹配等各种相互作用产生高特异性的结合力。通过化学改性技术可修饰于固体吸附剂表面，在固相萃取技术中具备极大的应用潜力。适配体亲和力高、特异性强以及相对于抗体、酶生物大分子识别体系的诸多优点使其在固相微萃取技术方面具有广阔的应用潜力，但有研究结果表明核酸适配体在复杂样品如血浆、尿液中存在酶解问题，限制了其使用寿命，同时纤维状固相微萃取头适配体键合量有限，萃取容量低(小于1ng)，制约了方法的应用。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供一种核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球，具有稳定的分子印迹聚合物刚性识别空穴和强特异性识别、吸附能力，而且其中的核酸适配体稳定性好、不易酶解。本专利技术的技术方案如下：一种核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球，包括磁性微球内核和核酸适配体-分子印迹协同识别外壳，微球内核和核酸适配体-分子印迹协同识别外壳之间通过化学键连接，所述核酸适配体-分子印迹协同识别外壳具有分子印迹聚合物刚性识别空穴。所述核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球的制备方法，包括以下步骤：(1)制备氨基修饰磁性微球：制备Fe3O4微球，并对所得Fe3O4微球进行SiO2包裹，得到SiO2/Fe3O4微球，然后加入氨基硅烷化试剂对SiO2/Fe3O4微球进行氨基改性，得到氨基修饰磁性微球；(2)制备核酸适配体修饰磁性微球：将步骤(1)所得的氨基修饰磁性微球分散于缓冲溶液中，加入EDC/NHS溶液活化，然后加入核酸适配体溶液，振荡反应，得到核酸适配体修饰磁性微球；(3)制备核酸适配体-分子印迹涂层磁性微球：将步骤(2)所得的核酸适配体修饰磁性微球分散于缓冲溶液中，加入模板分子及功能单体，振荡孵育；然后加入交联剂及引发剂，在无氧条件下进行自由基聚合反应，得到核酸适配体-分子印迹涂层磁性微球；(4)制备核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球：采用洗脱溶剂洗脱除去步骤(3)所得微球中的模板分子，形成分子印迹聚合物刚性识别空穴，得到核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球。进一步，在步骤(1)中，所述的氨基硅烷化试剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷；所述的氨基硅烷化试剂与SiO2/Fe3O4微球的摩尔比为25:1～75:1。进一步，在步骤(2)和步骤(3)中，所述的缓冲溶液为Tris-HCl(三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸)缓冲溶液，其pH值为4.5～8.5。优选地，所述Tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.5。进一步，在步骤(2)中，所述EDC/NHS溶液中的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的摩尔比为4:1～1:4。优选地，所述EDC/NHS溶液中的EDC与NHS的摩尔比为1:4。进一步，在步骤(2)中，所述的核酸适配体为赭曲霉毒素A核酸适配体(OTA核酸适配体)。所述的核酸适配体与氨基修饰磁性微球的摩尔比为75:1～150:1。进一步，在步骤(3)中，所述的振荡孵育包括以下步骤：a)将核酸适配体修饰磁性微球分散于缓冲溶液中，加入模板分子，在室温下振荡孵育；b)经磁分离后，用缓冲溶液清洗，除去未结合的模板分子；c)加入功能单体，在室温下振荡孵育。进一步，在步骤(3)中，所述的模板分子为赭曲霉毒素A(OTA)，所述的模板分子与核酸适配体修饰磁性微球的摩尔比为5:1～15:1；所述的功能单体为α-甲基丙烯酸、N-异丙基丙烯酰胺、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、丙烯酰胺中任意一种，所述的功能单体与核酸适配体修饰磁性微球的摩尔比为1:1～6:1。优选地，所述的功能单体为α-甲基丙烯酸。进一步，在步骤(3)中，所述的交联剂为N,N-亚甲基双丙烯酰胺；所述的引发剂为过硫酸铵溶液与四甲基乙二胺的混合物。进一步，在步骤(4)中，所述的洗脱溶剂为甲醇与乙酸的混合溶液，其中，甲醇与乙酸的体积比为50:50～90:10。本专利技术所述的核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球可用于分散本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸适配体‑分子印迹协同识别磁性微球的制备方法，包括以下步骤：(1)制备氨基修饰磁性微球：制备Fe3O4微球，并对所得Fe3O4微球进行SiO2包裹，得到SiO2/Fe3O4微球，然后加入氨基硅烷化试剂对SiO2/Fe3O4微球进行氨基改性，得到氨基修饰磁性微球；(2)制备核酸适配体修饰磁性微球：将步骤(1)所得的氨基修饰磁性微球分散于缓冲溶液中，加入EDC/NHS溶液活化，然后加入核酸适配体溶液，振荡反应，得到核酸适配体修饰磁性微球；(3)制备核酸适配体‑分子印迹涂层磁性微球：将步骤(2)所得的核酸适配体修饰磁性微球分散于缓冲溶液中，加入模板分子及功能单体，振荡孵育；然后加入交联剂及引发剂，在无氧条件下进行自由基聚合反应，得到核酸适配体‑分子印迹涂层磁性微球；(4)制备核酸适配体‑分子印迹协同识别磁性微球：采用洗脱溶剂洗脱除去步骤(3)所得微球中的模板分子，形成分子印迹聚合物刚性识别空穴，得到核酸适配体‑分子印迹协同识别磁性微球。

【技术特征摘要】
1.一种核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球的制备方法，包括以下步骤：(1)制备氨基修饰磁性微球：制备Fe3O4微球，并对所得Fe3O4微球进行SiO2包裹，得到SiO2/Fe3O4微球，然后加入氨基硅烷化试剂对SiO2/Fe3O4微球进行氨基改性，得到氨基修饰磁性微球；(2)制备核酸适配体修饰磁性微球：将步骤(1)所得的氨基修饰磁性微球分散于缓冲溶液中，加入EDC/NHS溶液活化，然后加入核酸适配体溶液，振荡反应，得到核酸适配体修饰磁性微球；(3)制备核酸适配体-分子印迹涂层磁性微球：将步骤(2)所得的核酸适配体修饰磁性微球分散于缓冲溶液中，加入模板分子及功能单体，振荡孵育；然后加入交联剂及引发剂，在无氧条件下进行自由基聚合反应，得到核酸适配体-分子印迹涂层磁性微球；(4)制备核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球：采用洗脱溶剂洗脱除去步骤(3)所得微球中的模板分子，形成分子印迹聚合物刚性识别空穴，得到核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的氨基硅烷化试剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷；所述的氨基硅烷化试剂与SiO2/Fe3O4微球的摩尔比为25:1～75:1。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(2)和步骤(3)中，所述的缓冲溶液为Tris-HCl缓冲溶液，其pH值为4.5～8.5。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述EDC/NHS溶液中的EDC与NHS的摩尔比为4:1～1:4。5.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡小刚，巫宝霞，张晓婷，马艳霞，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东,44