一种从蛹虫草培养基下脚料中提取并分离纯化多糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种从蛹虫草培养基下脚料中提取并分离纯化多糖的方法，该方法包括以下步骤：将蛹虫草大米培养基下脚料粉碎后加水回流提取，将提取液浓缩，加入乙醇静置过夜，离心取沉淀为蛹虫草培养基多糖提取物；多糖提取物加入H2O2脱色，然后加入木瓜蛋白酶酶解，再加入Sevage试剂，离心取上清，为粗多糖；上离子交换层析柱，用NaCl溶液进行梯度洗脱，得到多个多糖组分。采用本发明专利技术的方法可以完成大通量的多糖提取操作，适用于工业化大规模生产，DEAE离子交换层析柱分离效果好，重复性好，所得到的多糖组分纯度高、性质稳定。

A method for isolation and purification of Polysaccharides from Cordyceps militaris medium waste

The invention discloses a method for extracting and purifying polysaccharides from the leftovers of Cordyceps militaris culture medium. The method comprises the following steps: crushing the leftovers of Cordyceps militaris culture medium, adding water to reflux and extracting, concentrating the extract, adding ethanol to stand overnight, centrifuging and extracting polysaccharides from Cordyceps militaris culture medium; Sugar extract was decolorized by adding H2O2, then papain hydrolysis was added, then Sevage reagent was added, and the supernatant was centrifuged to be crude polysaccharide. The method of the invention can complete the high flux polysaccharide extraction operation, and is suitable for industrial large-scale production. The DEAE ion exchange chromatography column has good separation effect, good repeatability, and the obtained polysaccharide components have high purity and stable properties.

【技术实现步骤摘要】
一种从蛹虫草培养基下脚料中提取并分离纯化多糖的方法
本专利技术涉及一种从蛹虫草培养基下脚料中提取并分离纯化多糖的方法。
技术介绍
蛹虫草(C.militaris)又称北虫草，分类学上属于子囊菌亚门、核菌纲、球壳菌目，与北冬虫夏草同属麦角科虫草属，主要分布在我国东北、华北、西北等地区。蛹虫草可寄生于鳞翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫的幼虫或蛹体上，能采用家蚕蛹、大米培养基等进行人工批量培育。由于天然的蛹虫草资源有限，目前人工栽培的较多，主要有三种培养方法：(1)采集野生的蛹虫草，进行菌种的分离、纯化，然后将蛹虫草菌种接种在含蚕蛹粉的大米等固体培养基上，在一定的温度、湿度和光照条件下，培养35-45d获得蛹虫草子实体；(2)将蛹虫草菌种接种在家蚕幼虫或活蛹体内，在一定的温度、湿度和光照条件下，培养35-45d获得蛹虫草子实体；(3)以大豆粉蔗糖或玉米浆蔗糖为培养基，采用液体发酵培养蛹虫草。我国采用人工方法培养蛹虫草子实体的生产已有相当规模，但在子实体收获的同时，也产生了大量的蛹虫草培养基下脚料，不仅造成环境的污染，也是不可忽视的资源浪费。研究表明，蛹虫草培养基下脚料中含有虫草素、虫草多糖等生物活性物质。因此为了更好地开发利用蛹虫草资源，提高经济效益，完善蛹虫草产业链，对蛹虫草培养基下脚料的利用和研究开发已成为必要。中国专利申请(申请号201110086808.2)公开了一种从蛹虫草培养基中提取多糖的方法，利用不同的酶液来去除蛹虫草培养基中的蛋白、淀粉，再经醇沉得到蛹虫草培养基粗多糖；其操作过程复杂，成本较高，且不能将多糖进一步分离纯化，无法得到纯度较高的多糖组分。专利
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从蛹虫草培养基下脚料中提取并分离纯化多糖的方法，利用超声波辅助水提醇沉法对蛹虫草废弃培养基进行多糖提取，并通过离子交换层析法对多糖进行分离纯化，由此提取分离出纯度较高、具有生物活性的多糖组分。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种从蛹虫草培养基下脚料中提取并分离纯化多糖的方法，包括以下步骤：(1)提取蛹虫草培养基多糖：将蛹虫草大米培养基下脚料干燥后粉碎，过筛得下脚料干粉；称取干粉加入15-16倍质量的蒸馏水，超声波处理30min以上，在70-80℃下回流提取1.5-2.0h，提取若干次合并提取液，提取液过滤后浓缩，得到多糖浓缩液；在多糖浓缩液中加入3-4倍体积的95％(V/V)乙醇，搅拌后于4℃中静置过夜；离心后将沉淀烘干得到蛹虫草培养基多糖提取物；步骤(1)所述的过筛优选过40目筛；步骤(1)所述的浓缩优选在50-55℃下浓缩；步骤(1)所述的离心优选5000r/min离心15min；(2)蛹虫草培养基多糖的脱色：将蛹虫草培养基多糖提取物加蒸馏水溶解，调节pH值至8.0-8.5，滴加H2O2溶液至无色，50-55℃保温2h以上；步骤(2)所述的H2O2溶液，浓度优选30％(V/V)；(3)酶法结合Sevage法脱蛋白：3-1：将木瓜蛋白酶溶液与蛹虫草培养基多糖提取液混合，两者的体积比为1.0:1.5～1.0:1.7，60-70℃酶解2-3h；所述的木瓜蛋白酶溶液用pH值6.0的PBS缓冲液配制而成，其中木瓜蛋白酶的浓度优选250U/ml；3-2：在酶解液中加入1/5体积的Sevage试剂，振荡培养30min以上，然后多次离心直至无蛋白沉淀析出为止，取上清液，烘干得到蛹虫草培养基粗多糖；步骤(3)所述的Sevage试剂，是氯仿和正丁醇按体积比5:1配制而成；步骤(3)所述的振荡培养，摇床转速优选150r/min；步骤(3)所述的离心优选4000r/min离心20-30min；(4)蛹虫草培养基多糖的分离纯化：将蛹虫草培养基粗多糖用蒸馏水溶解后上DEAE琼脂糖凝胶FF(DEAESephroseFastFlow)离子交换层析柱，用NaCl溶液进行梯度洗脱，得到多个多糖组分；步骤(4)所述的梯度洗脱，NaCl溶液的浓度分别是0、0.1、0.3、0.5、0.7、1mol/L；多糖的分离纯化不仅是一个除杂的过程，同时也是将混合多糖分离为单一组分的过程。柱层析法可分为离子交换层析和凝胶柱层析。离子交换层析是依据离子电荷密度的不同而进行分级分离，阴离子交换剂的电荷基团带正电，反离子带负电，因此这种交换剂可以与溶液中的负电荷化合物或阴离子进行交换反应，而阳离子交换剂则反之。将琼脂糖凝胶与DEAE(二乙基氨基乙基)结合成为弱碱型离子交换剂，其填料带有正电荷，在低盐条件下可以通过电荷相互作用吸附多糖样品中的阴离子和负电荷物质。这些带负电的物质由于其带电量不同，分子大小不同，因此与正电填料之间的结合力也就不同。当用氯离子(通常是NaCl溶液)洗脱样品时，氯离子会和填料结合上的负电荷物质竞争结合正电填料，伴随着氯离子浓度的不断升高，氯离子的竞争作用越来越强，与填料结合的多糖就会按照亲和力从弱到强依次被洗脱下来，形成独立的洗脱峰，从而将粗多糖分离开来，得到不同的组分。这是梯度洗脱的原理。本专利技术通过水提醇沉法得到蛹虫草培养基粗多糖，利用离子交换层析柱进行粗多糖的分离纯化，相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本专利技术充分利用了培养蛹虫草而产生的培养基下脚料，符合变废为宝的绿色环保理念，建立了一条完整可行的蛹虫草培养基多糖提取、分离纯化、理化性质、结构和生物活性研究的技术路线，完善了人工培养蛹虫草产业的残渣处理工艺，为食用菌多糖的提取分离纯化提供了技术指导。(2)本专利技术所用的水提醇沉法可以完成大通量的多糖提取操作，成本较低，重复性好，得率高，适用于工业化大规模生产。(3)本专利技术所用的DEAESephroseFastFlow理化稳定性和机械性能更好，交换容量大，可以在位清洗，床体积随pH值的离子强度变化很小，由于流速和载量高，适合于进行大量粗产品的纯化工作。(4)采用本专利技术的提取方法不影响蛹虫草培养基多糖的生物活性，所得到的多糖纯品在抗氧化、降尿酸、抑菌方面具有显著效果，有益于人体代谢；成本较低，多糖纯品可进一步用于保健品、药品、化妆品的开发。(5)本专利技术创造性地将多糖的水提醇沉提取方法与离子交换层析分离纯化方法结合起来用于蛹虫草培养基下脚料多糖的研究，比较并得到较优的工艺参数，并确定DEAESephroseFastFlow作为层析柱填料，为蛹虫草培养基下脚料多糖的提取分离纯化提供技术指导和新思路。附图说明图1是蛹虫草培养基多糖的洗脱曲线图。图2是多糖P1的紫外光谱图。图3是多糖P2的紫外光谱图。图4是多糖P1的红外光谱图。图5是多糖P2的红外光谱图。图6是蛹虫草培养基多糖的ABTS自由基清除能力。图7是蛹虫草培养基多糖对金黄色葡萄球菌的抑菌实验结果；图8是蛹虫草培养基多糖对绿脓杆菌的抑菌实验结果；其中，1-多糖P1产生的抑菌圈，2-多糖P2产生的抑菌圈，0-对照组。具体实施方式下面结合实施例及图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例中，所得到的蛹虫草培养基多糖组分P1、P2的理化性质分析由中国广州分析测试中心进行，报告编号分别为2018001306-1b、2018001306-2b。实施例1一种从蛹虫草培养基下脚料中提取并分离纯化多糖的方法，包括以下步骤：(1)提取蛹虫草培养基多糖：称取55g蛹虫草大米培养基下脚本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从蛹虫草培养基下脚料中提取并分离纯化多糖的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)提取蛹虫草培养基多糖：将蛹虫草大米培养基下脚料干燥后粉碎，过筛得下脚料干粉；称取干粉加入15‑16倍质量的蒸馏水，超声波处理30min以上，在70‑80℃下回流提取1.5‑2.0h，提取若干次合并提取液，提取液过滤后浓缩，得到多糖浓缩液；在多糖浓缩液中加入3‑4倍体积的95％(V/V)乙醇，搅拌后于4℃中静置过夜；离心后将沉淀烘干得到蛹虫草培养基多糖提取物；(2)蛹虫草培养基多糖的脱色：将蛹虫草培养基多糖提取物加蒸馏水溶解，调节pH值至8.0‑8.5，滴加H2O2溶液至无色，50‑55℃保温2h以上；(3)酶法结合Sevage法脱蛋白：3‑1：将木瓜蛋白酶溶液与蛹虫草培养基多糖提取液混合，两者的体积比为1.0:1.5～1.0:1.7，60‑70℃酶解2‑3h；3‑2：在酶解液中加入1/5体积的Sevage试剂，振荡培养30min以上，然后多次离心直至无蛋白沉淀析出为止，取上清液，烘干得到蛹虫草培养基粗多糖；(4)蛹虫草培养基多糖的分离纯化：将蛹虫草培养基粗多糖用蒸馏水溶解后上DEAE琼脂糖凝胶FF离子交换层析柱，用NaCl溶液进行梯度洗脱，得到多个多糖组分。...

【技术特征摘要】
1.一种从蛹虫草培养基下脚料中提取并分离纯化多糖的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)提取蛹虫草培养基多糖：将蛹虫草大米培养基下脚料干燥后粉碎，过筛得下脚料干粉；称取干粉加入15-16倍质量的蒸馏水，超声波处理30min以上，在70-80℃下回流提取1.5-2.0h，提取若干次合并提取液，提取液过滤后浓缩，得到多糖浓缩液；在多糖浓缩液中加入3-4倍体积的95％(V/V)乙醇，搅拌后于4℃中静置过夜；离心后将沉淀烘干得到蛹虫草培养基多糖提取物；(2)蛹虫草培养基多糖的脱色：将蛹虫草培养基多糖提取物加蒸馏水溶解，调节pH值至8.0-8.5，滴加H2O2溶液至无色，50-55℃保温2h以上；(3)酶法结合Sevage法脱蛋白：3-1：将木瓜蛋白酶溶液与蛹虫草培养基多糖提取液混合，两者的体积比为1.0:1.5～1.0:1.7，60-70℃酶解2-3h；3-2：在酶解液中加入1/5体积的Sevage试剂，振荡培养30min以上，然后多次离心直至无蛋白沉淀析出为止，取上清液，烘干得到蛹虫草培养基粗多糖；(4)蛹虫草培养基多糖的分离纯化：将蛹虫草培养基粗多糖用蒸馏水溶解后上DEAE琼脂糖凝胶FF离子交换层析柱，...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄儒强，张竞雯，王静辉，高林林，王倩，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东,44