郑58/opaque2近等基因系中opaque2基因突变位点及其应用制造技术

本发明专利技术公开了郑58/opaque2近等基因系中opaque2基因突变位点及其高效分子标记和应用，本申请测序分析发现郑58/o2中o2基因ATG后713bp处缺失10个碱基，ORF预测O2蛋白翻译提前终止。针对突变缺失位点开发基因内共显性分子标记o2‑indel‑1，利用该标记进行回交转育，结果表明o2‑indel‑1与o2突变表型完全连锁，错选率为0。因此opaque2基因突变位点的解析有助于高效分子标记的开发，提高优质蛋白玉米育种选择效率。

Mutation site of opaque2 gene in Zheng 58/opaque2 near isogenic line and its application

The present invention discloses mutation sites of opaque2 gene in Zheng 58/opaque2 near-isogenic line and their high-efficiency molecular markers and applications. Sequencing analysis shows that 10 bases are missing at 713 BP after ATG of O2 gene in Zheng 58/o2, and ORF predicts early termination of O2 protein translation. The co-dominant molecular marker O2 indel_1 was developed for mutation deletion sites and was used for cross-breeding. The results showed that O2 indel_1 was completely linked to O2 mutation phenotype with a misselection rate of 0. Therefore, the analysis of mutation sites of opaque2 gene is helpful to the development of high-efficiency molecular markers and improve the selection efficiency of high-quality protein maize breeding.

【技术实现步骤摘要】
郑58/opaque2近等基因系中opaque2基因突变位点及其应用
本专利技术属于农业生物育种领域，具体涉及一种郑58/opaque2近等基因系中opaque2基因突变位点及其高效分子标记和应用。
技术介绍
玉米(ZeamaysL.)是世界第一大粮食作物,也是重要的饲料、经济兼用型作物。玉米籽粒的蛋白质含量一般在10％左右，从营养学观点看，普通玉米的蛋白品质比较差。普通玉米中赖氨酸的含量只有0.23％左右，而畜禽通常需要的饲料赖氨酸含量在0.6％-0.8％，目前不足部分需要通过添加较多的合成赖氨酸、豆饼和鱼粉等给予补充，这样极大地增加了饲料的成本。1964年，Mertz等首次发现玉米opaque2突变体胚乳赖氨酸含量比普通玉米高70％。Opaque2(O2)是一个能够特异调控22kDα-醇溶蛋白表达的转录因子。Opaque2通过结合到醇溶蛋白启动子顺式作用元件O2-box(TCCACGTAGA)，调控22-kDα-醇溶蛋白和15kDβ-醇溶蛋白等的表达。O2是目前鉴定的最主要的醇溶蛋白基因调控转录因子，其它发现的玉米转录因子PBF、OHP和ZmMADS47均与O2相互作用共同调控醇溶蛋白基因的表达。玉米成熟籽粒中α-醇溶蛋白超基因家族分为4个亚家族：Z1A、Z1B、Z1C、Z1D，其中三个基因家族Z1A、Z1B、Z1D编码19kDα-醇溶蛋白，其同源度在75％到95％之间。Z1C家族编码22kDα-醇溶蛋白，其成员基因之间的同源度大约有90％。利用分子标记进行优质蛋白玉米回交育种，o2供体以及分子标记的选择影响到选择的效率。Chen等(2014)研究发现CA339是一个启动子区域发生突变导致o2基因不表达的突变体，以CA339为o2供体材料，辽2345为受体材料，利用CA339o2基因内分子标记phi057回交转育过程中，发现辽2345/o2-1籽粒表型和醇溶蛋白表达恢复正常表型，结果发现CA339o2基因CDS导入，但是CA339突变启动子序列未导入辽2345，导致辽2345/o2-1中的o2基因在辽2345启动子驱动下正常表达并行使功能。o2基因突变位点的研究以及突变位点完全连锁分子标记的开发将有助于提高优质蛋白育种选择效率。因此我们对本研究室获得的郑58/o2近等基因系的籽粒表型、醇溶蛋白积累以及o2基因突变位点和蛋白质序列进行分析，同时开发高效分子标记，为优质蛋白玉米分子标记辅助育种提供高效分子标记。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种郑58/opaque2近等基因系中opaque2基因突变位点及其应用。本专利技术的另一目的在于提供一种郑58/opaque2近等基因系中opaque2突变基因及其应用。本专利技术的又一目的在于提供一种与上述opaque2基因突变位点完全连锁的分子标记及其应用。本专利技术的又一目的在于提供一种优质蛋白玉米分子标记辅助育种的方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种opaque2基因突变位点，该基因突变位点位于郑58/opaque2近等基因系中opaque2基因ATG后713bp处，并在opaque2基因ATG后713bp处缺失10个碱基。一种opaque2突变基因，该突变基因在郑58/opaque2近等基因系中opaque2基因ATG后713bp处缺失10个碱基。该突变基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。一种与上述opaque2基因突变位点完全连锁的分子标记，该分子标记为o2-indel-1，其引物序列为：o2-indel-1F：5’-TTTTAACTCCTGGGCTTATCG-3’，o2-indel-1R：5’-AGGTGAGCGGCTTTCCTGTAT-3’。上述分子标记的引物也是本专利技术保护的范围。上述的opaque2基因突变位点在优质蛋白玉米分子标记辅助育种中的应用。上述的分子标记及其引物在优质蛋白玉米分子标记辅助育种中的应用。一种优质蛋白玉米分子标记辅助育种的方法，利用上述的分子标记辅助选择转育opaque2突变基因。上述的优质蛋白玉米分子标记辅助育种的方法，其在于，利用上述分子标记的引物对郑58/o2供体和受体材料HA01构建的回交群体BC1F1进行分子标记选择，选择杂合基因型植株进行下一次回交，每次回交群体均利用所述的分子标记引物进行分子标记选择最终得到o2o2纯合基因型植株。本专利技术的有益效果：优质蛋白玉米分子标记辅助育种过程中，opaque2突变体材料是最常用的高赖氨酸玉米供体。opaque2基因突变位点的详细解析有助于完全连锁分子标记的开发，有效降低错选率。因此本专利技术对已获得的郑58/o2近等基因系突变表型、突变位点以及连锁标记开发进行了详细研究。结果表明郑58/o2表现出典型的o2突变体表型，其籽粒赖氨酸含量显著增加，SDS-PAGE显示胚乳发育不同时期22-kDα-醇溶蛋白的积累均明显低于郑58。荧光定量PCR结果表明α-醇溶蛋白家族基因Z1A、Z1B、Z1C和Z1D的表达均显著低于郑58，但是荧光定量PCR实验发现郑58/o2胚乳发育不同时期O2基因均正常表达。测序分析发现郑58/o2中o2基因ATG后713bp处缺失10个碱基，ORF预测O2蛋白翻译提前终止。针对突变缺失位点开发基因内共显性分子标记o2-indel-1，利用该标记进行回交转育，结果表明o2-indel-1与o2突变表型完全连锁，错选率为0。因此opaque2基因突变位点的解析有助于高效分子标记的开发，提高优质蛋白玉米育种选择效率。附图说明图1为供试玉米材料不同基因型种子。其中，A,郑58；B,opaque2图2为籽粒发育不同时期醇溶蛋白SDS-PAGE带谱检测。图3为Opaque2基因及醇溶蛋白基因发育不同时期表达分析。图4为郑58与郑58/o2CDS序列扩增。图5为郑58与郑58o2近等基因系DNA序列比对分析。图6为郑58与郑58/o2蛋白质序列比对分析。图7为opaque2基因分子标记辅助选择电泳检测结果。其中，1,6,29:maker；2,8,31:郑58；3,7,30:郑58/o2；4:昌7-2；5:HA01；9-28:BC1F1不同单株带型；32-38:BC5F5不同单株带型。具体实施方式1材料与方法1.1试验材料供试的郑58/o2近等基因系以及对照材料郑58来自河南省农业科学院粮食作物研究所。郑58/o2近等基因系为掖478/o2与郑58回交六代自交转育而成的近等基因系自交后代。1.2玉米籽粒氨基酸检测1、样品制备：每样品取3个果穗,取中部1/3籽粒,充分混合,磨碎过60目筛。取过筛后的样品2g-10g，放入扁形称量瓶中(可用小培养皿)，瓶盖斜支于瓶边，置于101-105℃的烘箱中2-4小时，取出盖好，置干燥器内冷却0.5小时，称量。称量后再重新加热1小时，冷却0.5小时，称量。重复至前后称重不差2mg，并计算样品含水量。2、样品盐酸水解：制备好的样品，称取0.2g，加入5mL(6mol/L)HCl，充入氮气，封管，放入110℃的烘箱中过夜水解。取出冷却后，在100mL容量瓶中加入6mol/LNaOH至中性，将水解液过滤到此容量瓶中，用PH2.2的缓冲液(0.02mol/L的稀盐酸)洗涤水解管，过滤，最后定容至100mL。样品上机前需用0.45μm本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种opaque2基因突变位点，其特征在于，该基因突变位点位于郑58/opaque2近等基因系中opaque2基因ATG后713bp处，并在opaque2基因ATG后713bp处缺失10个碱基。

【技术特征摘要】
1.一种opaque2基因突变位点，其特征在于，该基因突变位点位于郑58/opaque2近等基因系中opaque2基因ATG后713bp处，并在opaque2基因ATG后713bp处缺失10个碱基。2.一种opaque2突变基因，其特征在于，该突变基因在郑58/opaque2近等基因系中opaque2基因ATG后713bp处缺失10个碱基。3.根据权利要求1所述的opaque2突变基因，其特征在于，该突变基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。4.一种与权利要求1所述opaque2基因突变位点完全连锁的分子标记，其特征在于，该分子标记为o2-indel-1，其引物序列为：o2-indel-1F：5’-TTTTAACTCCTGGGCTTATCG-3’，o2-indel-1R：5’-AGGTGAGCGGCTTTCCTGTAT-3’。5.权利要求3所述分子标记的引物，其特征在于，其引物序列为：o2...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩小花，铁双贵，许蒙蒙，岳润清，郭书磊，夏彦，陈娜娜，刘璐，池海锋，傅晓雷，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：河南,41