The invention relates to the field of molecular biology technology, especially a preparation method of chimeric enzyme suitable for seamless cloning. The invention combines phage T7 5 '3' single chain exonuclease and T4 DNA polymerase to achieve seamless cloning, in order to further enhance the repeatability of the reaction system and reduce the production cost, the bacteriophage T7 5 ' Chimeric protein was constructed by fusion expression of 3'single strand exonuclease and T4 DNA polymerase, and expressed and purified in E. coli. The fusion protein is more suitable for the seamless clone system. It has good application effect, low cost and more suitable for industrialization. Deoxyribose nucleoside three phosphoric acid is added to the system after enzyme action, which can further improve the efficiency of cloning.
【技术实现步骤摘要】
一种适用于无缝克隆的嵌合酶的制备方法
本专利技术涉及分子生物学
,尤其涉及一种适用于无缝克隆的嵌合酶的制备方法。
技术介绍
分子克隆是近代分子生物学一种必用的手段,主要用有两种方法,一种是连接酶依赖性的(ligase-dependentcloning,LDC),另外一类是不依赖连接酶的(ligase-independentcloning,LIC)。其中LDC的使用最为广泛,它主要是将载体和待克隆的片段用合适的酶切,出现相同的粘端,实现互补,连接酶将切口连接上而产生新重组分子,其缺点是受到酶切位点的限制,操作也相对复杂,对于一些特殊的克隆,如用于转基因的基因克隆难免引入切点的序列,这些切点的序列给功能分析带来隐患。而LIC早期主要用于大片段的基因克隆,主要是对BAC克隆用同源重组的方法(Red/ET)进行改造,用于转基因,其优点是不受酶切位点的影响,也不会引入额外的序列,对于转基因等的功能分析非常合适,但操作也较为繁琐,常规的载体构建一般不采用该方法。无缝克隆最早问世的产品是In-fusionPCRcloningSystem,美国ClontechLaboratories,INC的产品,其原理是在PCR引物引入15bp和载体相同的序列,在T4DNA多聚酶和一种价格昂贵有知识产权的高保真酶的共同作用下,产生新的重组分子,是一种非常有效的克隆方法。其缺点是操作需要严格控制几个温度,先在37℃处理一段时间,然后在50℃或80℃处理一段时间,才完成重组分子的产生,操作相对麻烦,更主要是有知识产权的高保真酶价格非常昂贵,限制了其应用的发展。降低成本和简化操作是无缝 ...
【技术保护点】
1.一种适用于无缝克隆的嵌合酶的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:步骤一:将噬菌体T7的5’‑3’单链外切酶和T4 DNA多聚酶的基因,用PCR扩增后,回收二个基因的片段,二个片段中有一部分同源,将二个片段加入到PCR管子中,用噬菌体T7的5’‑3’单链外切酶基因的氨基端引物和T4 DNA多聚酶的基因羧基端引物,进行PCR扩增,得到5’‑3’单链外切酶和T4 DNA多聚酶融合基因片段,琼脂糖胶回收后,通过Nde I和Xho I位点亚克隆到pET28a表达载体中进行表达形成嵌合蛋白;步骤二:将上述的嵌合蛋白的表达载体导入到大肠杆菌BL21(DE3),进行表达,得到预期的嵌合蛋白;步骤三:将步骤二所得的提取蛋白经离子交换、氮三乙酸螯合亲和层析和肝素琼脂糖凝胶层析,得到纯化的嵌合蛋白;步骤四:将纯化的嵌合蛋白保存于磷酸钾、氯化钾、二硫苏糖醇和50%甘油的保存液中,即得到所述的嵌合酶。
【技术特征摘要】
1.一种适用于无缝克隆的嵌合酶的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:步骤一:将噬菌体T7的5’-3’单链外切酶和T4DNA多聚酶的基因,用PCR扩增后,回收二个基因的片段,二个片段中有一部分同源,将二个片段加入到PCR管子中,用噬菌体T7的5’-3’单链外切酶基因的氨基端引物和T4DNA多聚酶的基因羧基端引物,进行PCR扩增,得到5’-3’单链外切酶和T4DNA多聚酶融合基因片段,琼脂糖胶回收后,通过NdeI和XhoI位点亚克隆到pET28a表达载体中进行表达形成嵌合蛋白;步骤二:将上述的嵌合蛋白的表达载体导入到大肠杆菌BL21(DE3),进行表达,得到预期的嵌合蛋白;步骤三:将步骤二所得的提取蛋白经离子交换、氮三乙酸螯合...
【专利技术属性】
技术研发人员:周磊,
申请(专利权)人:上海捷瑞生物工程有限公司,
类型:发明
国别省市:上海,31
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