用于使RNA稳定的3’UTR序列制造技术

本发明专利技术涉及RNA、特别是mRNA的稳定化以及mRNA翻译的提高。本发明专利技术特别地涉及RNA、特别是体外转录RNA的修饰，其导致提高的转录物稳定性和/或翻译效率。根据本发明专利技术，其表明了在RNA分子的3’‑非翻译区(UTR)的某些序列提高稳定性和翻译效率。

3 'UTR sequence for making RNA stable

The invention relates to the stabilization of RNA, especially mRNA, and the improvement of mRNA translation. The present invention is particularly concerned with modification of RNA, especially in vitro transcription of RNA, resulting in improved stability and / or translation efficiency of transcripts. According to the invention, it shows that certain sequences in the 3 '- non translation region (UTR) of RNA molecules enhance stability and translation efficiency.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于使RNA稳定的3’UTR序列为了避免与DNA的治疗应用相关的潜在安全性风险，RNA的使用提供了有吸引力的DNA的替代方案。在治疗方法中，体外转录的RNA(invitro-transcribedRNA，IVT-RNA)是特别令人感兴趣的。RNA的治疗应用的优点包括瞬时表达和非转化特征。RNA不需要进入细胞核以进行表达，并且此外，RNA不会整合到宿主基因组中，从而消除肿瘤发生的风险。当用于疫苗接种时，RNA的注射可诱导体内细胞和体液免疫应答二者。然而，RNA用于临床应用的用途受到极大限制，尤其是由于RNA的短半衰期而受到极大限制。IVT载体可以以标准化方式用作体外转录的模板。这样的IVT载体可具有以下结构：能够实现RNA转录的5’RNA聚合酶启动子，随后是两侧为3’和/或5’以非翻译区(untranslatedregion，UTR)的目的基因，和含有A核苷酸的3’多聚腺苷酸盒。在体外转录之前，通过II型限制性酶(识别序列对应于切割位点)在多聚腺苷酸盒的下游使环状质粒线性化。因此，多聚腺苷酸盒对应于之后的转录物中的多聚(A)序列。人未成熟树突细胞(humanimmaturedendriticcell，hiDC)广泛用于开发和改善用于癌症治疗的免疫治疗。装载有编码特定肿瘤抗原(tumorantigen，TA)的体外转录(IVT)mRNA的情况下，hiDC能够诱导有效的抗肿瘤响应。然而，使用基于RNA的癌症疫苗的有效免疫应答的先决条件为RNA的高稳定性和翻译效率。二者都可通过5’-帽、3’多聚(A)尾以及5’和3’非翻译区(UTR)的结构修饰来改善。在UTR中的序列元件影响翻译效率(主要是5’-UTR)和RNA稳定性(主要是3’-UTR)。在之前的工作中，我们已经表明人β-珠蛋白3’-UTR的两个连续拷贝(现称为2hBg；之前也称为2βgUTR)有助于更高的转录物稳定性和翻译效率(Holtkamp(2006)Blood108：4009-4017)。然而，在最终用作体外RNA转录之模板的质粒DNA中存在人β-珠蛋白3’-UTR序列的两个相同拷贝的情况下，具有在其于大肠杆菌(E.coli)中增殖期间重组的风险。同样地，任何克隆方法，尤其是使用基于PCR的扩增的克隆方法都是非常困难的。对于待用作体外转录模板的在3’端具有2hBg的RNA编码区的基于PCR的扩增同样如此，因为在此已观察到错误引发(misprime)，其导致人β-珠蛋白3’-UTR的一个拷贝的遗失。为了避免这些问题，我们试图鉴定对体外转录的mRNA具有稳定作用的、至少与2hBg序列类似，理想地甚至更优于2hBg序列的新序列。本专利技术的目的是提供具有提高的稳定性和/或翻译效率的RNA和用于获得这样的RNA的方法。通过在治疗中使用所述RNA应可以获得提高的表达等级。这一目的根据本专利技术通过权利要求书的主题而实现。本专利技术涉及使RNA、特别是mRNA的稳定，以及mRNA翻译的提高。本专利技术特别地涉及对RNA、特别是体外转录的RNA进行修饰，使得提高转录物稳定性和/或翻译效率。根据本专利技术，已表明，某些序列在RNA分子的3’-非翻译区(UTR)中改善了稳定性和翻译效率。在转染树突细胞(DC)中使用根据本专利技术修饰的RNA，可以例如提高转染细胞上抗原特异性肽/MHC复合体的密度及其刺激和扩增抗原特异性CD4+和CD8+T细胞的能力。因此，在一个实施方案中，本专利技术涉及通过使用已经通过根据本专利技术所述的RNA修饰进行修饰的RNA来优化用于转染DC的RNA疫苗或RNA转染的DC疫苗的策略。根据本专利技术，RNA的修饰以及由此的稳定和/或翻译效率提高优选地通过对表达载体进行遗传修饰来实现，所述表达载体优选地用作体外RNA转录的模板。这些表达载体允许转录具有根据本专利技术所述并且优选地介于编码肽或蛋白质的序列(开放阅读框)和多聚(A)序列之间的3’-非翻译区的RNA。这些载体也可以允许具有这样的多聚(A)序列的RNA的转录，所述多聚(A)序列优选地在所述RNA中具有开放端，即所述多聚(A)序列在其3’端侧翼除A核苷酸之外没有其他核苷酸。RNA中的开放端多聚(A)序列可以通过将IIS型限制性切割位点引入表达载体中来实现，所述表达载体允许在5’RNA聚合酶启动子的控制下转录RNA，并且包含多聚腺苷酸盒，其中识别序列位于该多聚腺苷酸盒的3’，而切割位点位于上游并且因此在该多聚腺苷酸盒内。在IIS型限制性切割位点处的限制性切割使得能够在多聚腺苷酸盒内使质粒线性化。线性化的质粒随后可以用作体外转录的模板，所得转录物以未遮蔽的多聚(A)序列结束。此外，以具有四种核苷酸相等分布的随机核苷酸序列(接头)任选地中断3’多聚腺苷酸盒提高3’多聚腺苷酸盒在大肠杆菌中的稳定性。专利技术概述在一方面，本专利技术涉及核酸分子，其在5’→3’转录方向上包含：(a)启动子；(b)可转录核酸序列或用于引入可转录核酸序列的核酸序列；和(c)核酸序列，其当在启动子(a)的控制下转录时编码转录物中的3’-非翻译区，所述3’-非翻译区包含选自以下的核酸序列：(c-1)FCGRT的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c-2)LSP1的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c-3)CCL22的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c-4)AES的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c-5)PLD3的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c-6)MT-RNR1的非编码RNA的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c-7)HLA-DRB4的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，和(c-8)根据(c-1)、(c-2)、(c-3)、(c-4)、(c-5)、(c-6)和(c-7)的两个或更多个核酸序列、片段和/或变体的任意组合。在一个实施方案中，在启动子(a)的控制下的核酸序列(b)和(c)可以被转录以产生共同转录物，其中由核酸序列(c)转录的核酸序列具有活性以提高由可转录核酸序列(b)转录的核酸序列的翻译效率和/或稳定性。在一个实施方案中，核酸序列(b)和(c)未天然连接。在一个实施方案中，(c-4)AES的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体包含选自以下的核酸序列：选自SEQIDNO：86至89的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，(c-4)AES的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体包含选自以下的核酸序列：SEQIDNO：86的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，(c-6)MT-RNR1的非编码RNA的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体包含选自以下的核酸序列：选自SEQIDNO：105至121的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，(c-6)MT-RNR1的非编码RNA的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体包含选自以下的核酸序列：SEQIDNO：115的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，核酸序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.核酸分子，其在5’→3’转录方向上包含：(a)启动子；(b)可转录核酸序列或用于引入可转录核酸序列的核酸序列；和(c)核酸序列，其当在所述启动子(a)的控制下转录时，编码转录物中的3’‑非翻译区，所述3’‑非翻译区包含选自以下的核酸序列：(c‑1)FCGRT的3’‑非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c‑2)LSP1的3’‑非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c‑3)CCL22的3’‑非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c‑4)AES的3’‑非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c‑5)PLD3的3’‑非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c‑6)MT‑RNR1的非编码RNA的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c‑7)HLA‑DRB4的3’‑非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，以及(c‑8)根据(c‑1)、(c‑2)、(c‑3)、(c‑4)、(c‑5)、(c‑6)和(c‑7)的两个或更多个所述核酸序列、片段和/或变体的任意组合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.07 EP PCT/EP2015/0731801.核酸分子，其在5’→3’转录方向上包含：(a)启动子；(b)可转录核酸序列或用于引入可转录核酸序列的核酸序列；和(c)核酸序列，其当在所述启动子(a)的控制下转录时，编码转录物中的3’-非翻译区，所述3’-非翻译区包含选自以下的核酸序列：(c-1)FCGRT的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c-2)LSP1的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c-3)CCL22的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c-4)AES的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c-5)PLD3的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c-6)MT-RNR1的非编码RNA的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c-7)HLA-DRB4的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，以及(c-8)根据(c-1)、(c-2)、(c-3)、(c-4)、(c-5)、(c-6)和(c-7)的两个或更多个所述核酸序列、片段和/或变体的任意组合。2.权利要求1所述的核酸分子，其中在所述启动子(a)控制下的所述核酸序列(b)和(c)可以被转录以产生共同转录物，其中由所述核酸序列(c)转录的核酸序列具有活性以提高由所述可转录核酸序列(b)转录的核酸序列的翻译效率和/或稳定性。3.权利要求1或2所述的核酸分子，其中(c-4)AES的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体包含选自以下的核酸序列：选自SEQIDNO：86至89的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体。4.权利要求1至3中任一项所述的核酸分子，其中(c-4)AES的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体包含选自以下的核酸序列：SEQIDNO：86的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体。5.权利要求1至4中任一项所述的核酸分子，其中(c-6)MT-RNR1的非编码RNA的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体包含选自以下的核酸序列：选自SEQIDNO：105至121的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体。6.权利要求1至5中任一项所述的核酸分子，其中(c-6)MT-RNR1的非编码RNA的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体包含选自以下的核酸序列：SEQIDNO：115的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体。7.权利要求1至6中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸序列(c-8)包含根据(c-1)、(c-2)、(c-3)、(c-4)、(c-5)、(c-6)和(c-7)的两个或更多个相同或不同的核酸序列、片段和/或变体的组合。8.权利要求1至7中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸序列(c-8)包含(c-4)AES的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体与(c-6)MT-RNR1的非编码RNA的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体的组合。9.权利要求8所述的核酸分子，其中(c-4)AES的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体位于(c-6)MT-RNR1的非编码RNA的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体的5’。10.权利要求8或9所述的核酸分子，其中所述(c-4)AES的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体与(c-6)MT-RNR1的非编码RNA的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体的组合包含选自以下的核酸序列：SEQIDNO：174的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体。11.权利要求1至10中任一项所述的核酸分子，其还包含(d)核酸序列，其当在所述启动子(a)的控制下转录时，编码作为多聚腺苷酸序列的核酸序列，其任选地在所述多聚腺苷酸序列中包含含有除A核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列。12.权利要求11所述的核酸分子，其中所述多聚腺苷酸序列包含至少20个A核苷酸，优选至少40个、至少80个、至少100个或至少120个A核苷酸，优选连续A核苷酸。13.权利要求11或12所述的核酸分子，其中所述含有除A核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列是两个或更多个连续核苷酸的序列，优选任意序列，其中所述两个或更多个连续核苷酸的序列中的第一个和最后一个核苷酸是除A核苷酸之外的核苷酸。14.权利要求11至13中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸序列(d)是这样的核酸序列，其当在所述启动子(a)的控制下转录时，编码作为多聚腺苷酸序列的核酸序列，其在所述多聚腺苷酸序列中包含含有除A核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列，并且其在所述核酸分子在大肠杆菌(Escherichiacoli)中扩增之后，与包含核酸序列(d)’替代所述核酸序列(d)的核酸分子相比表现出更高的稳定性，所述核酸序列(d)’当在所述启动子(a)的控制下转录时，编码具有与所述作为多聚腺苷酸序列的、在所述多聚腺苷酸序列中包含含有除A核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列的核酸序列之相同长度的多聚腺苷酸序列。15.权利要求11至14中任一项所述的核酸分子，其中所述作为多聚腺苷酸序列的、任选地在所述多聚腺苷酸序列中包含含有除A核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列的核酸序列包含至少80个核苷酸，优选至少90或100个核苷酸。16.权利要求11至15中任一项所述的核酸分子，其中所述含有除A核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列位于所述多聚腺苷酸序列的第21位至第80位，优选第21位至第60位，更优选第31位至第50位的区域内。17.权利要求11至16中任一项所述的核酸分子，其中在所述含有除A核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列之前是所述多聚腺苷酸序列中的至少20个A残基和/或之后是所述多聚腺苷酸序列中的至少20个A残基。18.权利要求11至17中任一项所述的核酸分子，其中所述含有除A核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列的长度为至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少8个，优选至少10个，更优选至少15个核苷酸。19.权利要求11至18中任一项所述的核酸分子，其中所述含有除A核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：亚历山德拉·奥兰迪尼冯尼森，斯特凡妮·费塞尔，布丽塔·瓦拉扎，蒂姆·拜塞特，安德烈亚斯·库恩，乌尔·沙欣，马尔科·亚历山大·波莱加诺夫，
申请(专利权)人：生物技术RNA制药有限公司，约翰·古腾堡大学美因兹医学大学转化肿瘤学公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE