一种抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列及其用途和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列及其用途和检测方法。本发明专利技术公布了该PRRSV‑vsRNA1的成熟体序列以及编码PRRSV‑vsRNA1的前体序列和二级结构。本发明专利技术通过不同方法验证了此PRRSV‑vsRNA1在PRRSV感染的猪肺泡巨噬细胞(PAMs)及对于PRRSV高致病性毒株具有抑制作用。本发明专利技术阐明了抗PRRSV的PRRSV‑vsRNA1可以特异性靶向PRRSV病毒非结构蛋白2(Nsp2)，从而具有抑制PRRSV在PAMs细胞中增殖的功能。本发明专利技术涉及的PRRSV‑vsRNA1有望成为一种新型的防治猪蓝耳病的药物，为PRRSV的防控提供有效的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列及其用途和检测方法，具体涉及一种来源于猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组的microRNA样病毒小RNA的鉴定以及在抗PRRSV中的应用，本专利技术属于生物

技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)感染引起的一种严重危害世界养猪业的重要病毒性传染病，其主要特征为妊娠母猪流产、死产、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍、各年龄阶段猪的呼吸道症状。由于PRRS病毒具有抗原变异性、嗜巨噬细胞性、抗体依赖性增强作用(ADE)和持续性感染等特征，现有疫苗对该病的保护作用有限，目前还没有抗PRRS病毒的特效药物。microRNA是一类小的单链非编码RNA，其在病毒与宿主的相互作用中发挥着极其重要的转录后调控作用。一方面，病毒感染能够导致宿主编码的microRNA表达水平的改变，后者通过靶向病毒或者自身的基因，对病毒生命过程的诸多环节进行调控。另一方面，许多病毒同样可以编码microRNA调节宿主及病毒自身基因的表达，在病毒感染宿主细胞的过程中发挥重要作用。已有研究证实在PRRSV感染宿主细胞的过程中，宿主编码的microRNA对于PRRSV的感染扮演重要调控作用。而PRRSV编码的microRNA迄今并无相关的报道，本专利技术探索并鉴定了一种来源于病毒基因组的microRNA样病毒小RNA(PRRSV-vsRNA1)，能够通过调节自身基因的表达，进而调控病毒复制和增殖，这为深入了解PRRSV感染过程中病毒与宿主的相互作用以及PRRSV病毒的防控提供了全新的视角和策略。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列及其用途和检测方法，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。本专利技术所要解决的技术问题是提供鉴定来源于PRRSV的病毒小RNA的方法以及检测其作用机制。本专利技术提供了源于PRRSV的病毒小RNA的sense链序列：UGCUGACUUGGCGCAACACGU。本专利技术提供了源于PRRSV的病毒小RNA的前体序列：GUGAUGCGUCCAAGCUUAGUGAUCCUGCUACGCAGGAGUGGCUCUCUCGCAUGUGGGAUAGGGUUGACAUGCUGACUUGGCGCAACACGU。本专利技术提供了预测microRNA样病毒小RNA的二级结构以及最小结合自由能(MFE)的生物信息学方法。本专利技术提供了鉴定病毒小RNA所调控靶基因的双荧光素酶报告基因检测方法。本专利技术通过体外实验发现所提供的病毒小RNA具有抑制PRRSV复制的特性能够用于开发新型抗PRRSV药物。本专利技术所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：一种抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列，即PRRSV-vsRNA1，其特征在于，其核苷酸序列编码的RNA序列与SEQIDNO.1相同。SEQIDNO.1包含如下序列：UGCUGACUUGGCGCAACACGU。所述序列为RNA。所述抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列的前体RNA，其核苷酸序列编码的前体RNA序列与SEQIDNO.2相同。SEQIDNO.2包含如下序列：GUGAUGCGUCCAAGCUUAGUGAUCCUGCUACGCAGGAGUGGCUCUCUCGCAUGUGGGAUAGGGUUGACAUGCUGACUUGGCGCAACACGU。所述序列为RNA。其中，所述抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列，预测并鉴定其调控的靶基因位于PRRSV的非结构蛋白2(Nsp2)区域。PRRSV的非结构蛋白(Non-structuralprotein，Nsp)，简称Nsp。一种抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列的用途，其特征在于，所述抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列转染PAMs细胞达到抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在PAMs细胞中的复制及增殖的效果。一种抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：首先采用生物信息学预测microRNA样病毒小RNA的存在；然后通过双荧光素酶报告基因检测系统鉴定了病毒小RNA所调控的靶基因；最后通过qRT-PCR和TCID50的方法检测了病毒小RNA模拟物对PRRSV感染宿主细胞的影响，测试待测物抑制PRRSV复制和增殖的作用。本专利技术的有益效果：本专利技术首先采用生物信息学预测microRNA样病毒小RNA的存在。然后通过双荧光素酶报告基因检测系统鉴定了病毒小RNA所调控的靶基因。最后通过qRT-PCR和TCID50的方法检测了病毒小RNA模拟物对PRRSV感染宿主细胞的影响，并发现此模拟物具有显著抑制PRRSV复制和增殖的作用，这为PRRSV的防控提供了有效的方法。附图说明图1是本专利技术的PRRSV-vsRNA1前体序列的二级结构预测图。图2是利用双荧光素酶报告基因载体系统检测PRRSV-vsRNA1的靶基因。图3是利用qRT-PCR检测不同浓度PRRSV-vsRNA1模拟物转染PAMs细胞后对PRRSVORF7mRNA表达的影响。图4是利用qRT-PCR检测不同浓度PRRSV-vsRNA1模拟物转染PAMs细胞后对上清液中PRRSV基因组拷贝数的影响。图5是利用qRT-PCR检测100nM的PRRSV-vsRNA1模拟物转染PAMs细胞后在感染的不同时间对于PRRSVORF7mRNA表达的影响。图6是检测100nM的PRRSV-vsRNA1模拟物转染PAMs细胞后在感染的不同时间对于细胞上清液中PRRSV滴度的影响。具体实施方式以下结合具体实施例，对本专利技术作进步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限定本专利技术的范围。实施例中如无特殊说明，均为本领域常规实验技术。实施例中所用生物材料来源如下：DMEM培养基、Opti-MEM培养基与RPMI-1640培养基购于LifeTech公司；胰蛋白酶和胎牛血清购于BI公司；microRNA模拟物购于上海吉玛公司；引物由上海Invitrogen公司合成；FastStartUniversalSYBRGreenMaster以及siRNA转染试剂购于Roche公司；HS酶，RNA提取试剂(RNAisoPlus)，反转录试剂盒(PrimeScriptTMRTReagentKit)购于Takara公司；Trans10感受态细胞，DNA纯化试剂盒(EasyPureQuickGelExtractionkit)购于北京全式金生物技术公司；psiCheck2载体以及Dual-Luciferase双荧光素酶报告系统购于Promega公司；PAMs细胞为(猪肺泡巨噬细胞)分离于6周仔猪的肺脏组织；MARC-145细胞(恒河猴肾细胞MA-104的衍生细胞系)，高致病性PRRSV毒株GD-HD(GenBankID：KP793736.1)由西北农林科技大学兽医免疫生物学实验室保存。实施例1：PRRSV-vsRNA1的发现以及结构的预测1.序列下载：从miRBase网站(http：//www.mirbase.org/)中下载已报道的所有mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列(PRRSV‑vsRNA1)，其特征在于，其核苷酸序列编码的RNA序列与SEQ ID NO.1相同。

【技术特征摘要】
1.一种抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列(PRRSV-vsRNA1)，其特征在于，其核苷酸序列编码的RNA序列与SEQIDNO.1相同。2.根据权利要求1所述的一种抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列，其特征在于：所述抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列的前体RNA，其核苷酸序列编码的前体RNA序列与SEQIDNO.2相同。3.根据权利要求1所述的一种抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列，其特征在于：所述抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列，预测并鉴定其调控的靶基因位于PRRSV的非结构蛋白2(Nsp2)区域。4.一种抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列的前体RN...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖书奇，周恩民，李娜，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61