维持拷贝数的RNA分析方法技术

本发明专利技术提供由产生模板RNA分子的扩增的核酸部分的方法，包含在获得模板RNA后，使第一寡核苷酸引物在模板RNA的预先选定的3'末端核酸区域退火，以模板特异性方式延伸第一寡核苷酸引物，由此获得第一延伸链，去除RNA模板，使一或多个另外的寡核苷酸引物与所述第一延伸链退火，以模板特异性方式延伸所述一或多个另外的寡核苷酸引物而不链置换与所述第一延伸链退火的多核苷酸，或使用破坏被置换的链的聚合酶，由此产生另外的延伸产物，分离和/或扩增所述另外的延伸产物的延伸产物，其包含与所述第一寡核苷酸引物互补的延伸的核酸部分；本发明专利技术还提供进行该方法的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及RNA分析学方法，特别是转录子数量和类型估算测定。
技术介绍
基因表达是来自基因的信息用于功能性基因产物合成的过程。这些产物是功能性RNA，其中很重要的一类由蛋白编码信使RNA，mRNA组成，在该过程中其翻译成各种蛋白，如酶、转运分子等。对mRNA内容及其在细胞和组织中的加工阶段的了解对于理解细胞起源、疾病发生、有机体的药物响应以及其他生物学过程至关重要。细胞生物学过程受到各种内部和外部因素影响。其中完整RNA特别是mRNA库(转录组)起到重要作用。典型的哺乳动物细胞含有10-30pg总RNA，相当于平均3.6×105个mRNA分子。目前的人类基因组数据库包含20769个编码基因注解，48461个Genescan基因预测。虽然基因注解和基因预测的数目非常稳定，但由于RNA分析学的改进[Ensemblrelease73,Sept.2013]，注解的转录子数目(目前有195565个转录子)持续增加。许多研究主要集中在对蛋白编码RNA、mRNA或转录子的定量。单个基因能表达多种不同的转录子，称为剪接变体，其特征在于外显子区的不同，和/或对于调控过程至关重要的非翻译区起始和结尾位点的不同。已经开发了具有不同准确程度的不同的方法测量mRNA或基因表达水平。表达序列标签EST是cDNA的短子序列，来自克隆cDNA的单次测序。它们过去用于鉴定基因转录子。公共数据库中提供上百万的EST，其提供关于相应基因表达条件的信息。EST使得能够设计用于DNA微阵列的探针，测量基因表达。例如微阵列杂交测定的经典的基因表达测量方法，或者更近一些的方法例如大量同步测序或下一代测序(NGS)受限于这些方法内在的不准确性，其当前只能通过更多的测量例如深度测序而在一定程度上弥补，对于无法在高通量样品规模上进行的分析，这不可避免地在一定程度上增加成本。然而，测量中的准确性以及成本是药理学研究和大的临床规模研究中的最重要的要求。微阵列仅能在外显子或序列水平检测基因，为此在实验前已经设计了预先确定的序列探针。有限数目的这些杂交探针和错误杂交经常给高分辨率基因表达实验带来含糊的结果。微阵列设计受限，因为它们仅能覆盖一定数目的不同的3’UTR(3’非翻译区)，而不能鉴定新的3’UTR。1996年末开始出现不同于当时以Sanger命名的常规双脱氧法的新的高通量测序技术(WO98/44151)，称为下一代测序(NGS)。新测序技术的发展使得有可能尝试对整个转录组进行测序。NGS使用微型化和平行放置的流动池对数百万短的(长50-400个碱基)单个或成对末端读段进行测序。对空间分隔的、克隆化扩增的DNA模板通过合成进行测序，由此在单个核苷酸添加到互补链时进行解码。不同的微流体平台中使用光扫描(IlluminasystemsfromIllumina,Inc.,US；SOLiDsystemsfromLifeTechnologies,US；Roche454from454LifeSciences,RocheDiagnosticsCorp.,US)和通过排列的微芯片场效应晶体管(IonTorrentfromLifeTechnologies,US)的pH微弱变化的检测。数百万的短读段必须与已知序列匹配或从头组装。而对于RNA研究，情况更复杂，因为来自单个基因的序列在很大程度上重叠。之前发现的转录变体的注解提供框架，基于单个外显子、外显子-外显子连接和覆盖可能性指导后续转录子组装。只有正确的转录子组装允许将读段分配到其亲代RNA分子，以及进一步的计算各个拷贝的数目。与NGS技术无关，同时确定序列和频率信息是研究复杂序列混合物的一个主要问题。因为仅其序列决定分子性质，看似重复测定与其丰度成比例的相同分子，计算其相应的拷贝数是不可避免的。六个数量级的动态范围要求对数百万相同的高峰度分子进行重复测序，以获得低丰度分子统计学可靠的数值。这些方式在测序和后续数据分析过程中消耗资源和时间。所需的读段深度严重依赖于样品的复杂性(Hopper,2010；Wendl,2009)。毕竟，一个主要的挑战是将重叠读段与各个基因中的多个重叠转录子注解匹配的纠结。读段深度和计算的努力和成本巨大。因此，已经开发出不同的方式，通过每个mRNA分子仅产生一个读段，消除匹配重叠读段的需求。对这些读段的分组和计数简化了mRNA和基因表达测量(WO02/059357)。前体mRNA的聚腺苷酸化是真核基因表达和调控的一个重要步骤。许多基因产生具有可变聚腺苷酸化位点(APA)及不同的3’UTR的mRNA，所述mRNA可被差异化调控，或也可编码不同的蛋白亚型。因此，为了将通过每个mRNA仅产生一个读段来确定基因表达数值的简便与聚腺苷酸化位点的准确鉴定组合，开发了专门针对那些APA的方法。一种该方法以基因组范围和链特异性方式鉴定polyA位点(Wilkening,2013)。其中，NGS测序文库如下制备：加热使RNA样品片段化，固相可逆化固定(SPRI)，通过缓冲液更换而纯化以防止进一步片段化，用生物素化且锚定的polyT(V)-引物-接合体引导(priming)后逆转录，SPRI纯化以去除所有不含polyA的片段并更换溶液，RnaseH处理降解RNA并用较小RNA片段作为第二链合成的随机起始序列，其使用DNA聚合酶，产生最长的可能的双链，因为所有其他内部延伸的引导位点将通过链置换被置换，SPRI纯化，链霉亲和素亲和纯合和结合，使得在后续3个步骤的每个之后进行溶液更换，酶促末端修复，单dA加尾，连接另一接合体，之后是富集PCR，以及SPRI纯化。产生的NGS文库每个mRNA分子仅包含一个读段，尽管每个mRNA一个读段标记了理论最大值。实践中，由于文库产生的诸多反应步骤的每一步的效率均低于100％，结果是对转录子丰度的扭曲表示，并且是在期往实现中的等比例的扭曲表示。重要的是每个转录子种类的读段数目与其拷贝数目而非其长度或任意其他序列特异性偏倚成比例。该劳动力、化学制品及消费密集型方法有利于基因表达测量，因为其允许通过简单的读段计数对RNA丰度进行定量，因为每个转录子仅产生一个读段。该方法继之以具体的NGS方案，其在真正的测序开始前默默地读通引物-接合体的polyT区段。这部分名为3’T填充法。另外，polyA位点同种型的表达水平可以单核苷酸序列的分辨率，或在非常接近的polyA位点与相应簇重合后进行检测和定量。除了在读段产生中更好的质量之外，该方案主要的改进是引入所述3’T填充，其使得可以从转录子最末端进行测序。其他polyA位点富集方法之前已被开发，但没有前述3’T填充。由于缺少转录子变体的内参，很难判断这些方法的不同质量。更简单的一个方法是polyA连接序列的多重分析，MAPS[Fox-Walsh,2011]。其中，生物素化的含有接头序列的oligo-dT(NV)用于引导cDNA合成。经固相选择，通过使用连接至另一接头序列的随机引物启动第二链的合成。最后，文库从链霉亲和素包被的珠释放，并使用带条码的引物以及通用引物进行扩增。该方法同样具有强力检测基因表达的能力。尽管阅读方向最初指向mRNA的3’端，并且仅有非常窄的大小的文库选择能读入polyA位点，但接头(引物)序列的更换以及与本文档来自技高网...

【技术保护点】
从模板RNA分子产生核酸产物的方法，包含在获得模板RNA后a)使第一寡核苷酸引物在模板RNA的预先选定的核酸区域退火，b)以模板特异性方式延伸所述第一寡核苷酸引物，由此获得第一延伸链，c)去除RNA模板，d)使一或多个另外的寡核苷酸引物与所述第一延伸链退火，e)以模板特异性方式延伸所述一或多个另外的寡核苷酸引物而不置换与所述第一延伸链退火的引物，或使用破坏被置换的链的聚合酶，由此产生另外的延伸产物，f)分离和/或扩增所述另外的延伸产物的延伸产物，其包含与所述第一寡核苷酸引物互补的延伸的核酸部分。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.21 EP 14161135.01.从模板RNA分子产生核酸产物的方法，包含在获得模板RNA后a)使第一寡核苷酸引物在模板RNA的预先选定的核酸区域退火，b)以模板特异性方式延伸所述第一寡核苷酸引物，由此获得第一延伸链，c)去除RNA模板，d)使一或多个另外的寡核苷酸引物与所述第一延伸链退火，e)以模板特异性方式延伸所述一或多个另外的寡核苷酸引物而不置换与所述第一延伸链退火的引物，或使用破坏被置换的链的聚合酶，由此产生另外的延伸产物，f)分离和/或扩增所述另外的延伸产物的延伸产物，其包含与所述第一寡核苷酸引物互补的延伸的核酸部分。2.权利要求1的方法，其中所述预先选定的核酸区域是3’末端核酸区域，其优选包含poly-A尾。3.权利要求1或2的方法，其中所述方法还包含将3’多核苷酸尾附着至模板RNA的3’末端的步骤，其中所述预先选定的3’末端核酸区域包含所述3’多核苷酸尾。4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述第一寡核苷酸引物和/或另外的寡核苷酸引物是DNA。5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述第一寡核苷酸引物和/或另外的寡核苷酸引物包含非退火序列标签或接头序列，其优选用于扩增引物的结合。6.权利要求5的方法，其中所述非退火序列标签或接头序列包含条码，优选随机条码。7.权利要求1-6任一项的方法，其中b)以模板特异性方式延伸第一寡核苷酸引物是通过逆转录，并且所述第一延伸链是DNA链。8.权利要求1-7任一项的方法，其中c)去除RNA模板包含酶促RNA消化，优选通过RNase，碱性降解，优选通过NaOH处理，或在二价阳离子，优选Mn2+或Mg2+存在下加热。9.权利要求1-8任一项的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·默尔，
申请(专利权)人：莱克斯奥根有限公司，
类型：发明
国别省市：奥地利;AT