在具有降低的CLR1活性的丝状真菌中生产蛋白质的方法技术

本发明专利技术涉及在丝状真菌中生产重组多肽的方法，所述丝状真菌经遗传修饰以降低或消除纤维素酶调节物1(CLR1)的活性并表达所述重组多肽。该方法还涉及经遗传修饰以降低或消除CLR1活性的丝状真菌嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)，以及该丝状真菌在生产重组多肽中的用途。

Method for producing protein in filamentous fungi with reduced CLR1 activity

The present invention relates to a method for producing recombinant peptides in filamentous fungi, which are genetically modified to reduce or eliminate the activity of the cellulase regulator 1 (CLR1) and to express the recombinant polypeptide. The method also involves the use of genetic modification to reduce or eliminate the CLR1 activity of the filamentous fungi (Myceliophthora thermophila), and the use of the filamentous fungi in the production of recombinant peptides.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在具有降低的CLR1活性的丝状真菌中生产蛋白质的方法专利
本专利技术涉及在丝状真菌中生产重组多肽的方法，所述丝状真菌经遗传修饰以降低或消除纤维素酶调节物1(CLR1)的活性并表达所述重组多肽。该方法还涉及经降低或消除CLR1活性的遗传修饰的丝状真菌嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)，以及该丝状真菌在生产重组多肽中的用途。专利技术背景已显示丝状真菌是用于生产多种蛋白质的优异宿主。真菌菌株如曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)和毁丝霉属(Myceliophthora)已被应用于大范围的酶的工业生产，因为它们可以将大量蛋白质分泌入发酵肉汤中。这些真菌的蛋白质分泌能力使它们成为特定酶或酶混合物靶向生产的优选宿主。然而，通常，这些宿主分泌许多不同酶的混合物，使得粗蛋白质产物不明确并且对于目的蛋白质需要复杂的纯化方案。即使在编码目标酶的基因通过遗传修饰过度表达的情况下，目标酶也只构成总分泌蛋白的一小部分。因此，非常需要提供一种真菌生产系统，其能够分泌大量的特定酶而不存在高水平的其他蛋白质。这样的生产系统将能够生产相对纯的酶和简化的大规模纯化所需的酶。所产生的酶可以用于不同的应用，例如，用于食品和饲料应用、洗涤剂或家庭护理以及植物生物质水解(生物燃料和化学品)、纺织品整理以及造纸和纸浆工业。WO2010/107303A2描述了嗜热毁丝霉菌株的UV诱导的诱变，这导致产生少量内源性纤维素酶和蛋白酶的分离物。Visser等人(2011)IndustrialBiotechnology7(3)：214-223公开了称为LC(低纤维素酶)菌株的嗜热毁丝霉菌株，所述菌株几乎丧失了其全部产生纤维素酶的能力。然而，仍然需要一种用于在丝状真菌中生产重组多肽的有效方法。专利技术目的和概述这个需求由本专利技术解决。本专利技术人出人意料地发现丝状真菌如嗜热毁丝霉中纤维素酶调节物1(CLR1)活性的降低导致具有产生增加纯度的重组多肽的能力的菌株。因此，一方面，本专利技术提供了一种在丝状真菌中生产重组多肽的方法，该丝状真菌被遗传修饰以与不具有该遗传修饰且与被遗传修饰的丝状真菌在相同条件下培养的丝状真菌相比降低或消除了CLR1的活性，并且该丝状真菌被进一步遗传修饰以表达所述重组多肽，其中该重组多肽在不能被CLR1活化的启动子的控制下表达，所述方法包括：(i)在不含有能够诱导CLR1活性的纤维素或其纤维素衍生物的培养基中生长所述经遗传修饰的丝状真菌；和(ii)从培养基中分离重组多肽。另一方面，本专利技术提供了一种在丝状真菌中生产重组多肽的方法，该丝状真菌被遗传修饰以与不具有该遗传修饰且与被遗传修饰的丝状真菌在相同条件下培养的丝状真菌相比降低或消除CLR1的活性，并且该丝状真菌被进一步遗传修饰以表达所述重组多肽，其中该重组多肽在不能被CLR1活化的启动子的控制下表达，所述方法包括：(i)在不含有能够诱导CLR1活性的纤维素或其纤维素衍生物的培养基中生长所述经遗传修饰的丝状真菌；和(ii)从培养基中分离重组多肽。丝状真菌可以是嗜热毁丝霉菌。另一方面，本专利技术涉及一种丝状真菌嗜热毁丝霉，其经遗传修饰以与不具有该遗传修饰且与被遗传修饰的丝状真菌在相同条件下培养的丝状真菌相比降低或消除CLR1的活性，并且该丝状真菌被进一步遗传修饰以表达重组多肽，其中所述重组多肽在不被CLR1活化的启动子的控制下表达。另一方面，本专利技术涉及一种丝状真菌嗜热毁丝霉，其经遗传修饰以与不具有该遗传修饰且与被遗传修饰的丝状真菌在相同条件下培养的丝状真菌相比降低或消除CLR1的活性，并且该丝状真菌被进一步遗传修饰以表达重组多肽，其中所述重组多肽在不被CLR1活化的启动子的控制下表达。重组多肽可以是异源多肽。在本专利技术的方法或丝状真菌的一个实施方案中，重组多肽是水解酶。在一个实施方案中，所述遗传修饰的丝状真菌能够以比所述不具有遗传修饰且与遗传修饰的丝状真菌在相同条件下培养的丝状真菌更高的纯度积累重组多肽。CLR1活性的降低或消除可能是由于编码CLR1蛋白的核酸分子表达的减少或消除。在一个实施方案中，编码CLR1蛋白的核酸分子包含选自以下的核酸序列：(a)根据SEQIDNo.1或2的核酸序列或其功能部分；(b)编码根据SEQIDNo.3的多肽或其功能部分的核酸序列；和(c)编码具有CLR1活性且与根据SEQIDNo.1或2的核酸序列具有至少70％序列同一性的多肽的核酸序列。丝状真菌可以包含至少一种额外的遗传修饰。所述至少一种额外的遗传修饰可以降低或消除CLR1以外的转录因子的活性，优选地降低或消除木聚糖酶调节物1(XYR1)的活性。额外地或备选地，所述至少一种额外的遗传修饰可以降低或消除蛋白酶，优选地碱性蛋白酶1(ALP1)的活性。另一方面，本专利技术涉及降低或消除CLR1活性的核酸构建体用于提高丝状真菌中产生的重组多肽的纯度和/或量的用途。CLR1的活性可以通过减少编码CLR1蛋白的核酸分子的表达来降低。在一个实施方案中，编码CLR1蛋白的核酸分子包含选自以下的核酸序列：(a)根据SEQIDNo.1或2的核酸序列或其功能部分；(b)编码根据SEQIDNo.3的多肽或其功能部分的核酸序列；和(c)编码具有CLR1活性且与根据SEQIDNo.1或2的核酸序列具有至少70％序列同一性的多肽的核酸序列。又一方面，本专利技术涉及如本文所定义的丝状真菌用于生产重组多肽的用途。附图简述：图1示出了亲本菌株(HC-manT；空心方块)和clr1基因缺失的菌株(HC_manT_Δclr1#α；实心圆圈)的甘露聚糖酶比活性，以总的U/mg蛋白质表示，其中蛋白质在培养期间不同的时间点获得。图2示出了来自亲本菌株HC_manT和clr1缺失菌株HC_manT_Δclr1#α的发酵样品的上清液的SDS-PAGE分析。加载等量的总蛋白质。图3示出了与亲本菌株UV18#100fΔpyr5Δalp1Δku70相比，来自clr1缺失菌株UV18#100fΔpyr5Δalp1Δku70Δclr1#α的等体积上清液的SDS-PAGE分析。专利技术详述本专利技术涉及允许在丝状真菌中生产重组多肽的改良手段和方法，所述丝状真菌经遗传修饰以降低或消除CLR1的活性并表达重组多肽。尽管将针对特定实施方案描述本专利技术，但是本说明书不应被解释为限制意义。在详细描述本专利技术的示例性实施方案之前，给出对于理解本专利技术重要的定义。如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式的“一”和“一个”还包括各自的复数形式。在本专利技术的上下文中，术语“大约”和“约”表示本领域技术人员将理解的仍然确保所讨论特征的技术效果的准确性区间。该术语通常表示与指示数值±20％，优选±15％，更优选±10％，甚至更优选±5％的偏差。应该理解，术语“包括/包含”不是限制性的。为了本专利技术的目的，术语“由...组成”被认为是术语“包括/包含”的优选实施方案。如果在下文中将组定义为包含至少一定数量的实施方案，这也意味着还涵盖优选仅由这些实施方案组成的组。此外，在说明书和在权利要求书中的术语“第一”，“第二”，“第三”或“(a)”，“(b)”，“(c)”，“(d)”等以及类似术语用于区分相似的要素本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.在丝状真菌中生产重组多肽的方法，所述丝状真菌经遗传修饰以与不具有该遗传修饰且与被遗传修饰的丝状真菌在相同条件下培养的丝状真菌相比降低或消除纤维素酶调节物1(CLR1)的活性，并且该丝状真菌被进一步遗传修饰以表达所述重组多肽，其中所述重组多肽在不能被CLR1活化的启动子的控制下表达，所述方法包括：(i)在不含纤维素或其能够诱导CLR1活性的任何衍生物的培养基中生长所述经遗传修饰的丝状真菌；和(ii)从培养基中分离重组多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.02 EP 15197493.81.在丝状真菌中生产重组多肽的方法，所述丝状真菌经遗传修饰以与不具有该遗传修饰且与被遗传修饰的丝状真菌在相同条件下培养的丝状真菌相比降低或消除纤维素酶调节物1(CLR1)的活性，并且该丝状真菌被进一步遗传修饰以表达所述重组多肽，其中所述重组多肽在不能被CLR1活化的启动子的控制下表达，所述方法包括：(i)在不含纤维素或其能够诱导CLR1活性的任何衍生物的培养基中生长所述经遗传修饰的丝状真菌；和(ii)从培养基中分离重组多肽。2.如权利要求1所述的方法，其中丝状真菌是嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)。3.一种丝状真菌嗜热毁丝霉，其经遗传修饰以与不具有该遗传修饰且与被遗传修饰的丝状真菌在相同条件下培养的丝状真菌相比降低或消除纤维素酶调节物1(CLR1)的活性，并且该丝状真菌被进一步遗传修饰以表达重组多肽，其中所述重组多肽在不能被CLR1活化的启动子的控制下表达。4.如权利要求1或2所述的方法或如权利要求3所述的丝状真菌，其中所述重组多肽是对丝状真菌异源的多肽。5.如权利要求1、2或4中任一项所述的方法或如权利要求3或4所述的丝状真菌，其中所述重组多肽是水解酶。6.如权利要求1、2、4或5中任一项所述的方法或如权利要求3至5中任一项所述的丝状真菌，其中所述遗传修饰的丝状真菌能够以比不具有该遗传修饰且与被遗传修饰的丝状真菌在相同条件下培养的丝状真菌更高的纯度积累重组多肽。7.如权利要求1、2或4至6中任一项所述的方法或如权利要求3至6中任一项所述的丝状真菌，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·哈夫纳，A·提维森，H·哈特曼，N·伯默尔，
申请(专利权)人：巴斯夫欧洲公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE