本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种控制水稻耐冷性的基因及其应用。从水稻中分离了一种受冷胁迫诱导的基因OsCPK24，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。将OsCPK24的CDS克隆到pC1300s上，得到超表达载体；将含有SEQ ID NO：3的序列克隆到pDS1301上，得到RNAi抑制表达载体，分别转入水稻品种日本晴中，获得OsCPK24超表达转基因系和抑制表达系。冷胁迫下，获得的超表达转基因系存活率比野生型要高，抑制转基因系存活率比野生型要低，表明OsCPK24基因具有调节水稻耐冷性的功能。本发明专利技术为植物和水稻抗寒育种提供了新的资源。
A gene for controlling the cold tolerance of rice and its application
The invention belongs to the technical field of plant gene engineering, in particular to a gene for controlling cold tolerance of rice and its application. A gene OsCPK24 induced by cold stress was isolated from rice, and its nucleotide sequence, as shown by SEQ ID NO:1, was shown by the sequence of protein encoded by the gene, such as SEQ ID NO:2. The CDS of OsCPK24 was cloned to pC1300s, and the overexpression vector was obtained. The sequence of SEQ ID NO:3 was cloned to pDS1301, and RNAi inhibition expression vector was obtained, and the OsCPK24 overexpression transgenic line and inhibition expression line were obtained. Under cold stress, the survival rate of the overexpressed transgenic lines was higher than that of the wild type, and the survival rate of the transgenic lines was lower than that of the wild type, indicating that the OsCPK24 gene had the function of regulating the cold tolerance of rice. The invention provides new resources for cold resistant breeding of plants and rice.
【技术实现步骤摘要】
一种控制水稻耐冷性的基因及其应用
本专利技术属于植物基因工程
具体涉及一种控制水稻耐冷性的基因OsCPK24及其应用。
技术介绍
水稻(Oryzasativa)是世界第二大粮食作物，产量约占世界粮食总产的1/3。水稻起源于热带或亚热带地区，属于喜温作物，对低温很敏感。低温冷害是影响水稻稳定生产的主要逆境之一。全球每年约有1500万hm2水稻受到寒冷胁迫(Louetal.,2007.Euphytica158:87-89)，在南亚和东南亚约有700万hm2面积因低温影响不能种植现代水稻品种(Sthapitetal.,1998.CropSci38:660-666)，而我国每年因冷害损失稻谷约50亿kg(潘英华等，2010，中国农学通报，2010，26(17)：54-59)。水稻芽期和苗期冷害多发生在我国长江流域早稻区和云、贵、川等高纬度及高海波一季中稻区，这些稻区在水稻生长前期常遇寒潮侵袭，非耐冷品种幼芽和幼苗停止生长，易导致烂秧、死苗或弱苗、抽穗分散，成熟期不一致等现象，严重影响水稻产量(Andayaetal.,2003.JExpBot54:2579-2585；Fujinoetal.,2004.TheorApplGenet108:794-799；Kosekietal.,2010.MolGenetGenom284:45-54)。不仅如此，水稻的耐冷性还直接关系到水稻栽培区域及复种面积的扩大。因此，挖掘水稻内源抗冷基因，研究其抗冷分子机理，对于培育耐冷水稻品种，提高水稻产量具有重要指导意义(Zhouetal.,2012.BreedingSci62:196-201)。Ca2+作为一种重要的第二信使，可引起细胞内多种特异性的反应应答。在植物中，钙离子浓度的变化调控着下游的效应分子，影响着植物生长发育、抵御非生物逆境和生物逆境等多个重要过程(Harperetal.,2004.AnnuRevPlantBiol55:263-288)。钙依赖蛋白激酶(Calcium-dependentproteinkinases,CDPKsorCPKs)就是接受并传递这种Ca2+信号的效应分子之一。CPKs是一类大的蛋白激酶家族，属于丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶，活性直接受Ca2+的调控而不依赖钙调素(CaM)和磷脂(Harperetal.,2004.AnnuRevPlantBiol55:263-288)。这类蛋白激酶首先在大豆中发现，后来被证实广泛存在于各种植物、绿藻和原生动物中，但在酵母、线虫、果蝇以及哺乳动物的细胞中没有发现它们的存在。典型的CPK分子是由4个结构域组成的单条多肽链，包括N末端的可变结构域、激酶活性结构域、自抑制结构域和C末端钙调结构域(Hrabaketal.,2003.PlantPhysiol132:666-680.苏氨酸激酶结构域；自抑制结构域又称连接结构域，序列具有高度的保守性；C末端钙调结构域由2–4个可以结合Ca2+的EF手相结构域组成。研究证明，CPKs在植物非生物逆境应答中扮演重要角色。最早发现CPKs参与响应非生物胁迫过程的是Urao等，他们在脱水处理1h的拟南芥中分离到了AtCPK10(AtCDPK1)和AtCPK11(AtCDPK2)两个基因，通过Northernblot分析证明AtCPK10和AtCPK11基因的表达受干旱和高盐诱导，而不受低温和高温诱导(Uraoetal.,1994.MolGenGenet244:331-340.)。Zou等研究表明，过表达AtCPK10的转基因植株耐旱性增强，相反Atcpk10突变体对干旱胁迫的敏感性增加。进一步研究发现，AtCPK10与热激蛋白HSP1互作，可能通过ABA和Ca2+介导的气孔关闭过程参与耐旱性调节(Zouetal.,2010.PlantJ24:445-458)。核和膜定位的AtCPK3正向参与盐胁迫信号转导途径，在盐胁迫下，AtCPK3激酶活性增强与MAPK途径突变体相比cpk3突变体表现出更明显的盐敏感性(Mehlmeretal.,2010.PlantJ63:484-498)。与此功能相同的还有膜定位的AtCPK27，其表达受盐胁迫诱导上调，在种子萌发和萌发后幼苗生长过程中cpk27突变体对盐胁迫更敏感(Zhaoetal.,2015.Gene563:203-214)，以及与AtCPK3一起调节气孔关闭的AtCPK6，其表达受盐和渗透胁迫诱导，虽然其突变体没有明显的表型，但其过表达植物耐旱性和耐盐性增强(Xuetal.,2010.Planta231:1251-1260.)。作为基因组学研究的模式作物之一，水稻基因组中包含31个OsCPKs，除少数几个基因功能被报道之外，大部分基因功能还处于未知状态。基于CPKs在植物抗非生物逆境中的重要地位，本专利技术利用基因工程手段，结合遗传学和分子生物学等方法，对OsCPK24基因功能进行了研究，揭示了OsCPK24在水稻抗冷过程中具有重要作用，为培育水稻耐冷品种提供了新的基因资源。
技术实现思路
本专利技术的目在于提供一种调控植物特别是水稻耐冷性的基因OsCPK24，该基因从水稻品种日本晴中鉴定并分离克隆得到，该基因具有SEQIDNO:1所示的CDS序列，其编码的蛋白质序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术的另一个目的是提供OsCPK24基因在调控水稻耐冷性中的应用，通过CaMV35S启动子驱动OsCPK24基因在水稻植株中超量表达可达到冷胁迫下提高植株存活率的效果，从而提高水稻品种的耐逆性。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：(1)专利技术人通过反向遗传学方法，从逆境芯片表达谱中挑选受冷诱导上调表达的基因OsCPK24，利用qRT-PCR验证了OsCPK24受冷诱导。(2)申请人通过基因克隆方法得到一种调控水稻耐冷性基因OsCPK24：PCR反应扩增，反应体系的总体积为20μL，模板为日本晴cDNA1μL(约10ng)、10×ExTaq酶反应缓冲液2μL、5mMdNTP2μL、5μM正向引物0.2μL、5μM反向引物0.2μL、0.2μLExTaq酶，加ddH2O(无菌去离子水)至20μL。反应程序为：94℃变性5min，94℃40s、60℃40s、72℃1min32循环，72℃延伸10min。正向引物:ggatccCAAGGCAAGAAGTTGGGTG；反向引物:ctgcagAGCACAATTCACTCTCTTCGGC；最终获得如SEQIDNO:1所示的基因OsCPK24(1-1542bp)，该基因编码的蛋白质序列如SEQIDNO:2所示。(3)OsCPK24基因在调控水稻耐冷性中的应用，包括将OsCPK24全长CDS克隆到超表达载体pCAMBIA1300s上(pCAMBIA1300s载体改造自pCAMBIA1300(http://www.cnki.net/，叶水烽，水稻CDPKs基因的表达谱分析和黑藻Hvppc2转基因水稻的培育和功能分析。[博士学位论文]。武汉：华中农业大学图书馆，2009))，该载体的构建图如图2所示。将OsCPK24(1238-1376bp)核苷酸序列(如SEQIDNO:3所示，138bp)，克隆到RNAi抑制表达载体pDS1301上，将上述所得的两个表达载体分别转入水稻本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种分离的蛋白，其蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。
【技术特征摘要】
1.一种分离的蛋白，其蛋白质序列如SEQIDNO：2所示。2.编码权利要求1所述蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1中第1-1542位碱基所示的序列。3.一个超量表达载体p1300s-OsCPK24，其特征在于，该载体含有权利要求2所述的基因。4.权利要求1所述的蛋白在调控水稻抗冷性中的应用。5.权利要求2所述的基因在改善水稻耐冷性和提高水稻冷胁迫下产量的应用。6.一种提高植物耐冷性的方法，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：林拥军，刘瑜，许纯珏，张利娜，周菲，马伟华，陈浩，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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