抗埃博拉病毒VP40蛋白单克隆抗体G7A6及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗埃博拉病毒VP40蛋白单克隆抗体G7A6及其应用。该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，能与ZEBOV‑VP40蛋白N端抗原肽特异性结合，发挥抗病毒效应；产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆和传代流程筛选后获得的杂交瘤细胞，能稳定分泌G7A6，抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No.1，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。G7A6具备拮抗扎伊尔型埃博拉病毒样颗粒的抗病毒效应，可以其它单抗联合应用。

Anti Ebola virus VP40 protein monoclonal antibody G7A6 and its application

The invention discloses an anti Ebola virus VP40 protein monoclonal antibody G7A6 and its application. The monoclonal antibody subtype is IgG1 and kappa type, which can combine with the ZEBOV VP40 protein N end antigen peptide specifically and play an antiviral effect. The hybridoma cells produced by the monoclonal antibody are derived from the fusion, screening, cloning and transmission process of the immune BALB/C mouse spleen lymphocyte and mouse myeloma cell SP2/0. The tumor cells can secrete G7A6 steadily, and the heavy chain amino acid sequences of the antibodies are SEQ ID No.1 and light chain amino acid sequences, such as SEQ ID No.2. G7A6 has antiviral effect against Zaire Ebola like particles and can be combined with other monoclonal antibodies.

【技术实现步骤摘要】
抗埃博拉病毒VP40蛋白单克隆抗体G7A6及其应用
本专利技术属于生物
，涉及抗扎伊尔型埃博拉病毒VP40蛋白单克隆抗体的制备及应用，是利用细胞工程、抗体工程技术，获得分泌抗VP40蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，通过同品系的小鼠诱导腹水，制备抗VP40蛋白的单克隆抗体G7A6，鉴定为IgG1、κ型，通过基因测序明确抗体的序列，再通过亲和纯化、电泳、免疫、基因工程等技术实现对该抗体的应用。
技术介绍
埃博拉病毒病是由埃博拉病毒感染引起的致死性出血热。1976年，埃博拉病毒首次在苏丹南部和刚果（金）（旧称扎伊尔）发现，后陆续在中非地区小规模爆发，截止2013年，共造成2387人发病，死亡1310例，病死率54.9%。2014年埃博拉病毒再次爆发，以扎伊尔型埃博拉病毒为主要毒株，席卷西非，并跨越大洲，美国、英国、西班牙相继发生埃博拉病例。截止2016年12月31日，共报告28712例病例（含确诊及可疑病例），死亡11372例，死亡率39.6%。尽管自西非疫情以来，针对埃博拉病毒快速诊断、抗病毒药物、疫苗等研究等方面已经取得很大进展，但目前国际上仍没有特异的治疗手段和可供临床推广应用的疫苗。埃博拉病毒病已经成为国际性重大传染病，研究抗埃博拉病毒治疗对人类的安全至关重要。研究表明，埃博拉病毒GP及VP40蛋白在埃博拉病毒病的致病机制中担任重要作用，GP蛋白与病毒入侵、胞膜融合密切相关，VP40蛋白在促进膜融合，维持病毒颗粒完整性,协助病毒出芽等方面发挥重要作用。因此，GP及VP40蛋白是研究药物、疫苗等的重要靶点。目前，有多种埃博拉病毒GP及VP40单克隆抗体得到鉴定，但多数用于快速诊断，仅有数个GP单克隆抗体在灵长类动物模型上验证了抗病毒效应，譬如，GP单克隆抗体mAb114;2个GP单克隆抗体的联合抗体MIL77E；3个GP单克隆抗体的联合：MB-003,ZMab和ZMappTM。当前，仅ZMappTM正在开展I/II期临床试验。但是具备抗埃博拉病毒效应的VP40单克隆抗体未见报道。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术提供了一种抗埃博拉病毒VP40蛋白单克隆抗体G7A6及其应用。一种抗埃博拉病毒VP40蛋白单克隆抗体G7A6，该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，能与ZEBOV-VP40蛋白loop区域抗原肽特异性结合，发挥抗病毒效应；产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆和传代流程筛选后获得的杂交瘤细胞，能稳定分泌G7A6，抗体的重链氨基酸序列如SEQIDNo.1，轻链氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。一种所述的单克隆抗体G7A6的制备方法，通过以下步骤获得：（1）小鼠免疫：选择6周龄的BALB/C雄性小鼠，以针对ZEBOV-VP40蛋白loop区域的特异的抗原肽14肽CTGKKVTSKNGQPI，SEQIDNo.3，对小鼠进行免疫，总共免疫3次，第1次免疫予100μg抗原肽加佐剂混匀后予小鼠大腿内侧肌肉注射免疫，第21天时，同等剂量抗原肽及佐剂混合物免疫第2次，第35天时，同等剂量抗原肽及佐剂混合物免疫第3次；第38天处理小鼠，用于融合实验；（2）小鼠骨髓瘤细胞的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使其保持良好的生长状态用于杂交瘤细胞融合；（3）细胞融合：采用聚乙二醇细胞融合法，以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合前一天，接种BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞于96孔培养板，用含20%FCS的HAT培养基培养一天，将步骤（1）中备好的小鼠通过颈椎脱臼法处死，取出脾脏，获取脾脏淋巴细胞，收集步骤（2）中的小鼠骨髓瘤细胞，将上述两种细胞混合离心，然后以聚乙二醇（PEG6000）介导细胞融合，融合后的细胞适当稀释，接种至细胞培养板，适当条件培养；（4）杂交瘤细胞的筛选：将上述培养物在含HAT选择性培养基中培养，在细胞集落长到大小合适时，吸取培养上清液以酶联免疫吸附检测法做抗体鉴定，筛选阳性克隆；（5）杂交瘤细胞的克隆化培养：以有限稀释法稀释阳性克隆的杂交瘤细胞，将稀释到一定密度的细胞接种至96孔细胞培养板，使每孔只有一个杂交瘤细胞生长，形成细胞集落的孔予吸取上清液做酶联免疫吸附检测，筛选和鉴定阳性克隆，直到杂交瘤细胞种植孔的阳性率达到100％，将克隆化后的杂交瘤细胞扩大培养并做抗体理化性状分析和鉴定；（6）小鼠腹水的诱生：在接种杂交瘤细胞前1周，给BALB/C小鼠腹腔注射降植烷0.5ml/只，然后每只接种生长良好的5×106阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水离心，测定抗体效价，并纯化腹水中的单克隆抗体；（7）单克隆抗体的纯化：利用ProteinG亲和纯化法纯化腹水中的单克隆抗体。一种所述的单克隆抗体G7A6的应用，用于检测在ZEBOV-VP40蛋白的表达，或者用于中和扎伊尔型埃博拉病毒。所述的扎伊尔型埃博拉病毒为构建的扎伊尔型埃博拉病毒样颗粒ZEBOV-trVLPs。所述的单克隆抗体G7A6与抗GP单克隆抗体ZJEB8-01、抗VP40单克隆抗体A2G7、抗VP40单克隆抗体F1B4之中的一个或者多个联合应用。本专利技术的有益效果：G7A6具备抗病毒效应，G7A6与抗GP单克隆抗体（ZJEB8-01）、其他抗VP40单克隆抗体(A2G7、F1B4)的联合应用具备更显著的抗病毒效应，将为抗扎伊尔型埃博拉病毒的治疗提供新的参考方案。附图说明图1.单克隆抗体G7A6的免疫球蛋白亚型分析；图2.单克隆抗体G7A6的腹水、培养上清液效价检测；图3.ZEBOV-trVLPs感染体外复制模型构建；图4.单克隆抗体G7A6拮抗trVLPs后检测trVLPsRNA水平；图5.单克隆抗体G7A6拮抗trVLPs后检测trVLPsGP蛋白表达；图6.单克隆抗体联合应用拮抗trVLPs后检测trVLPsRNA水平；图7.单克隆抗体联合应用拮抗trVLPs后检测trVLPsGP蛋白表达。具体实施方式以下结合附图和具体实施例来进一步阐述本专利技术。本专利技术选定扎伊尔型埃博拉病毒VP40蛋白为靶抗原，利用现代生物信息学和分子生物学技术，设计并合成针对VP40蛋白的特异抗原肽序列，采用融合杂交瘤技术建立稳定分泌抗VP40蛋白特异抗原蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，并大量制备、纯化和鉴定这些单克隆抗体。该单克隆抗体的成功获得，不仅为建立新型的埃博拉病毒病诊断方法——基于免疫学技术的诊断奠定基础，而且也为VP40单克隆抗体抗病毒及VP40单克隆抗体与GP单克隆抗体联合抗病毒的研究提供科学依据，为抗埃博拉病毒的治疗提供了新的方案。同时对疾病发病机理、诊断、预后及疗效判定等方面的研究起到重要作用。本专利技术用到杂交瘤细胞技术。该技术将免疫小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以建立分泌均质抗体的杂交瘤细胞系，也称为单克隆抗体技术。该技术涉及到动物免疫、细胞培养、细胞融合、细胞克隆培养和免疫测定等一系列方法。实施例1.抗埃博拉VP40蛋白的单克隆抗体G7A6的制备（1）小鼠的免疫：首次免疫，将交联KLH的埃博拉VP40蛋白的14肽（CTGKKVTSKNGQPI）与QuickAntibody-mouse5W按体积1:1混合均匀，总体积100ul。每BALB/C小鼠0.1ml（本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗埃博拉病毒VP40蛋白单克隆抗体G7A6，其特征在于，该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，能与ZEBOV‑VP40蛋白loop区域抗原肽特异性结合，发挥抗病毒效应；产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆和传代流程筛选后获得的杂交瘤细胞，能稳定分泌G7A6，抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No.1，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种抗埃博拉病毒VP40蛋白单克隆抗体G7A6，其特征在于，该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，能与ZEBOV-VP40蛋白loop区域抗原肽特异性结合，发挥抗病毒效应；产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆和传代流程筛选后获得的杂交瘤细胞，能稳定分泌G7A6，抗体的重链氨基酸序列如SEQIDNo.1，轻链氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。2.一种根据权利要求1所述的单克隆抗体G7A6的制备方法，其特征在于，通过以下步骤获得：（1）小鼠免疫：选择6周龄的BALB/C雄性小鼠，以针对ZEBOV-VP40蛋白loop区域的特异的抗原肽14肽CTGKKVTSKNGQPI，SEQIDNo.3，对小鼠进行免疫，总共免疫3次，第1次免疫予100μg抗原肽加佐剂混匀后予小鼠大腿内侧肌肉注射免疫，第21天时，同等剂量抗原肽及佐剂混合物免疫第2次，第35天时，同等剂量抗原肽及佐剂混合物免疫第3次；第38天处理小鼠，用于融合实验；（2）小鼠骨髓瘤细胞的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使其保持良好的生长状态用于杂交瘤细胞融合；（3）细胞融合：采用聚乙二醇细胞融合法，以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合前一天，接种BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞于96孔培养板，用含20%FCS的HAT培养基培养一天，将步骤（1）中备好的小鼠通过颈椎脱臼法处死，取出脾脏，获取脾脏淋巴细胞，收集步骤（2）中的小鼠骨髓瘤细胞，将上述两种细胞混...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚航平，余东山，李兰娟，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33