本发明专利技术公开了一种酶活提高的L‑天冬氨酸β‑脱羧酶突变体及其应用，属于基因工程领域。本发明专利技术的突变体是在SEQIDN0.2所示的氨基酸的基础上，将第484位亮氨酸突变成甲硫氨酸。因为表达包涵体问题将构建的重组载体L484M‑pET28aN端起始密码子后一段冗余序列删除得到重组质粒L484M‑pET28a‑M。本发明专利技术得到的突变体在大肠杆菌中表达，经纯化得到的酶做酶学性质研究，pH4.5、pH5.0、pH6.5下相对酶活分别提高了40％、36％、42％。L484M和未突变酶在相同酶活不同pH条件下进行全细胞转化1h取样测定产量，在最适pH5.5条件下，产量提高48.5％。本发明专利技术表明484位氨基酸残基对酶的催化作用有较大影响，对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础，并提高了该酶的工业应用潜力。
【技术实现步骤摘要】
一种酶活提高的L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体及其应用
本专利技术涉及一种酶活提高的L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体及其应用，属于基因工程
技术介绍
L-丙氨酸是一种非必需氨基酸。随着对L-丙氨酸不断研究和开发，在食品、医药、化学合成等行业的应用不断扩大。L-丙氨酸是存在于许多食品中的一种氨基酸，已经用作饮食的添加剂，如防腐剂，风味调味料，氨基酸低度酒和饮料等。在医药上的应用，通过水解蛋白制成氨基酸输液，L-丙氨酸在治疗如肝病引起的蛋白质合成紊乱、糖尿病、急慢性肾功能衰竭以及对维持危急病人的营养、抢救患者的生命方面起到了积极作用；L-丙氨酸可以有效地减轻酒精对肝脏的损害；L-丙氨酸还是血液保存剂的主要成分等。在化学合成中的应用，如合成抗癌物4-羟基水杨醛丙氨酸合锌，合成VB5等。L-丙氨酸制备经历了由蛋白水解提取法、发酵法到酶法(固定化细胞法或游离整体细胞法)的过程。现在工业化生产的方法就是酶法转化，即通过富有L-天冬氨酸-β-脱羧酶活力的微生物(如Pseudomonasdacunhae等)细胞催化L-天冬氨酸而得到的，而L-天冬氨酸则可通过固定化EscherichiaColi高效地催化富马酸铵而制得。其中日本多采用固定化细胞法，而我国均采用游离整体细胞法。固定化法是将P.dacunhae用卡拉胶固定化与固定化大肠杆菌分别装柱串联，从而达到从富马酸铵到L-丙氨酸的连续化生产。M.Furui等人用密封的加压反应器，使CO2溶于混和液中，保证了平推流特性和防止细胞流失，很好的解决了天冬氨酸脱羧反应过程中的CO2释放从而破坏固定化细胞，导致细胞流失和流体出现返混现象问题，为了防止L-天冬氨酸-β-脱羧酶活力的固定化失活、pH调整失活和抑制丙氨酸消旋酶活力，在固定化前将整体细胞用醋酸、PLP溶液(pH4.75)和戊二醛进行处理。游离整体细胞法是将P.dacunhae发酵培养，以培养液作为酶源，直接添加固体L-天冬氨酸实现酶法转化。Goto.Markoto将P.dacunhae细胞用EDTA等表面活性剂处理来提高酶的活力；而抑制消旋酶可以通过调整酶催化反应的pH值进行，一般pH控制在4.5～5.5之间。游离整体细胞法的关键技术是如何提高酶活力和酶的稳定性、防止消旋酶的产生。Goto.Markoto的方法较好的解决了这些问题。综上所述，目前L-天冬氨酸β-脱羧酶催化合成L-丙氨酸缺陷，酶反应pH范围较窄，会导致pH调整失活，对过程控制要求较为严格等问题。本专利技术旨在对L-天冬氨酸β-脱羧酶进行突变，扩宽其pH作用范围，降低酶催化操作难度，提高其工业应用价值和生产效率。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种酶活提高L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是在氨基酸如序列SEQIDNO.2所示的氨基酸的基础上，将484位氨基酸由亮氨酸突变成甲硫氨酸。本专利技术的第二个目的是提供编码所述突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术的第三个目的是提供含有上述基因的重组表达载体，所述重组表达载体切除了载体N端起始密码子后一段冗余序列并在C端添加6个组氨酸标签。本专利技术的第四个目的是提供一种表达所述L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体的基因工程菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主。本专利技术的第五个目的是提供所述基因工程菌的制备方法，是在SEQIDNO.2所示氨基酸序列的基础上，将第484位亮氨酸突变成甲硫氨酸，得到重组基因，将重组基因连到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到大肠杆菌宿主菌中即得到大肠杆菌基因工程菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体是pET28a。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法具体是：(1)以SEQIDNO.4所示核酸序列为模板，以序列如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示的引物，进行PCR，得到编码的484位氨基酸由亮氨酸突变成甲硫氨酸的L484M突变体基因序列；(2)将步骤(1)得到的重组基因序列，连接到pET28a-M表达载体中，得到重组质粒L484M-pET28a-M，重组质粒化转化到大肠杆菌宿主中，获得重组大肠杆菌基因工程菌。本专利技术的第六个目的是提供所述的基因工程菌全细胞转化L-天冬氨酸生产L-丙氨酸的方法，其特征在于，所述方法是在pH为4-7的条件下，以基因工程菌全细胞作为催化剂，以L-天冬氨酸为底物转化生产L-丙氨酸。本专利技术的第七个目的是提供所述L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体在医药化工领域的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用是用于制备合成泛酸钙、肌肽、帕米磷酸钠、β-丙氨酸金属配合物或巴柳氮。本专利技术在天然L-天冬氨酸β-脱羧酶的基础上，通过定点突变生物技术改造L-天冬氨酸β-脱羧酶分子结构，突变体酶在pH4.5，pH5.0，pH6.5的缓冲液中相对酶活较原始酶分别提高40％，36％，42％。本专利技术表明484位氨基酸残基对酶的催化作用有较大影响，对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础，并提高了该酶的工业应用潜力。具体实施方式为了能够更清楚地理解本专利技术的
技术实现思路
，特举以下实施例详细说明，其目的仅在于更好理解本专利技术的内容而非限制本专利技术的保护范围。酶活定义：在45℃反应条件下，每分钟生成1μmolL-丙氨酸所需要的酶量为一个酶活单位。L-天冬氨酸β-脱羧酶酶活测定方法：以L-天冬氨酸为底物，通过HPLC法测定催化反应中生成的L-丙氨酸的量。酶活测定体系(1mL)：830μL0.2MpH5.5醋酸缓冲液，1mMα-酮戊二酸，0.1mMPLP，40mML-天冬氨酸溶液(用氢氧化钠调节pH至中性)，适当浓度的酶液。反应混合物在45℃，pH5.5条件下，反应30min后，沸水浴终止反应。反应混合物在14000g条件下离心10min，取上清稀释10倍，经过0.2mm滤膜，处理好的样品通过HPLC测定产物L-丙氨酸的浓度。实施例1：含L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体的重组载体的构建(1)L484M突变体的获得：以SEQIDNO.4所示核苷酸序列为模板，Fprimer(序列如SEQIDNO.5所示)、Rprimer(序列如SEQIDNO.6所示)为引物，进行PCR即得到SEQIDNO.3所示的重组基因。(2)质粒pET28a-M的构建：将重组表达载体L484M-pET28a起始密码子后一段冗余序列切除，新的表达载体记为L484M-pET28a-M。(3)将重组质粒L484M-pET28a-M化转至JM109感受态细胞，转化液涂布含卡那霉素(50μg/L)LB平板，提取质粒，送至上海生工测序。实施例2：产L-天冬氨酸β-脱羧酶大肠杆菌构建将实施例1得到的重组质粒L484M-pET28a-M化转至E.coliBL21感受态细胞，具体方法如下：(1)转化实验所需试剂如下：LB培养基：配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，摇动容器直至溶解,加入去离子水至总体积为1L，分装，高压灭菌20min。LB琼脂培养基：先按上述配方配制液体培养基，高压灭菌前加入琼脂1％-2％。100mmol/LCaCl2(灭菌)、50％甘油(灭菌)、50EP管，1.5m本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种L‑天冬氨酸β‑脱羧酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.编码权利要求1所述突变体的基因。3.一种含有权利要求2所述基因的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体切除了载体N端起始密码子后一段冗余序列并在C端添加6个组氨酸标签。4.一种表达权利要求1所述L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体的基因工程菌。5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主。6.一种制备权利要求4所述基因工程菌的方法，其特征在于，是在SEQIDNO.2所示氨基酸序列的基础上，将第484位亮氨酸突变成甲硫氨酸，得到重组基因，将重组基因连到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到大肠杆菌宿主菌中即得到大肠杆菌基因工程菌。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述方法具体是：(1)以SE...
【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，汪芳，杨套伟，徐美娟，张显，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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