本发明专利技术公开了一种采用磁微粒化学发光法测定人血清中可溶性生长刺激表达基因2蛋白(ST2)含量的试剂盒。试剂盒包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物；其中抗试剂异硫氰酸荧光素标记的可溶性生长刺激表达基因2蛋白包被抗体和碱性磷酸酶标记的可溶性生长刺激表达基因2蛋白标记抗体；磁微粒试剂为磁微粒与羊抗FITC连接物。本发明专利技术将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，并且采用了一步法反应模式，使得检测灵敏度、精密性大大提高、检测范围扩大，反应时间大大缩短，从开始加样到检测结果，时间少于35min,明显快于同类试剂盒；并且可以在全自动化学发光仪上同时测定多个样本，实现可溶性生长刺激表达基因2蛋白的高通量快速化测定，准确度高，特异性强，精确度和检测效率有了较大的提高。
【技术实现步骤摘要】
一种测定可溶性生长刺激表达基因2蛋白含量的试剂盒及其测试方法
本专利技术涉及生物化学
，具体涉及一种采用磁微粒化学发光法测定人体中可溶性生长刺激表达基因2蛋白(ST2)含量的试剂盒。
技术介绍
ST2作为新兴生物学标记物，具有生物变异性低、稳定性高、不受性别、年龄、种族、肾功能干扰等特点，在心衰患者的诊断、治疗及风险预测中发挥着重要作用，血清中的ST2水平与心衰的严重程度呈正相关，不受年龄、体重等指标的影响，在心血管疾病中发挥着阻断IL-33的抗心肌细胞肥大、抗心肌纤维化、抗动脉粥样硬化作用。此外在急性冠脉综合症发生发展中也可能发挥着重要作用，作为反映冠脉易损斑块稳定程度的炎症标志物以及心血管疾病不良预后的有效生物学标志物。还可作为潜在的代表心脏机械超负荷的有效生物学标志物，且独立于其他临床预测因子。目前已知的可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定方法酶联免疫吸附法(ELISA)。酶联免疫吸附法存在检测时间长、操作复杂、重复性差、不适于急诊和临床病人及时诊断的需要。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种准确度高的采用磁微粒化学发光法测定人血清中可溶性生长刺激表达基因2蛋白(ST2)含量的试剂盒。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了如下的技术方案：一种测定可溶性生长刺激表达基因2蛋白含量的试剂盒，包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物；所述磁微粒试剂是将抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制成，所述发光底物是将ALPS溶解于发光底物缓冲液中制成；分别配制校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物；将可溶性生长刺激表达基因2蛋白校准品、可溶性生长刺激表达基因2蛋白质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物，独立地置于包装容器内，得到可溶性生长刺激表达基因2蛋白的定量测定试剂盒；(一)、所述校准品、质控品的配制，包括以下步骤：用校准品缓冲溶液溶解可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗原，配制抗试剂的校准品和质控品；其中，所述校准品缓冲溶液是通过在1L的新生牛血清中加入0.01g～0.05g的四环素和0.1g～0.5g的硫酸新霉素，完全溶解后经过0.22μm滤膜处理制备而成；(二)、所述抗试剂的配制：1)抗试剂缓冲液的制备：将10g～20g的Na2PO3H·12H2O、1～2g的NaPO3H2·12H2O、1g～5g的绵羊血清、3g～10g的新生牛血清、1g～5g的马血清加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，用4MHCl调节pH至5～6，制得所述抗试剂缓冲液；2)异硫氰酸荧光素与可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体偶联，获得异硫氰酸荧光素标记的可溶性生长刺激表达基因2蛋白包被抗体：首先用缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液，然后按照可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体：异硫氰酸荧光素溶液＝1:1.1～1:1.5的质量比将二者转移到棕色玻璃瓶里，充分混匀；充分反应后使用pH为8～9的碳酸盐缓冲液平衡，然后使用凝胶层析分离纯化得到异硫氰酸荧光素标记的可溶性生长刺激表达基因2蛋白包被抗体；3)碱性磷酸酶与可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体偶联，获得碱性磷酸酶标记的可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体：首先用缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液，可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体和碱性磷酸酶分别将反应基团分别活化后按照摩尔比为碱性磷酸酶：可溶性生长刺激表达基因2蛋白＝1:1～1:3的反应比在催化剂的催化下充分混匀进行偶联反应，充分反应后，使用pH为8～9的tris缓冲液平衡，凝胶柱进行不同分子大小片度的分离纯化，得到碱性磷酸酶标记的可溶性生长刺激表达基因2蛋白标记抗体；将步骤2)中获得的异硫氰酸荧光素标记的可溶性生长刺激表达基因2蛋白包被抗体和步骤3)中获得的碱性磷酸酶标记的可溶性生长刺激表达基因2蛋白标记抗体加入含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液中，充分搅拌后获得所述抗试剂；优选的，所述步骤3)中的表面活性剂为Tween20、TritonX-100、Bronidox中的一种或多种，表面活性剂的添加量为0.01％～0.5％。进一步的，该试剂盒还包括清洗液，所述清洗液的配置方法将将160gNaCl、4gKCl、24.2g三羟甲基氨基甲烷、1mL吐温20溶于900ml双蒸水中，用HCL调整至PH7.4，用双蒸水定容至1000ml。使用时用双蒸水15倍稀释。进一步的，所述磁微粒试剂是按照以下步骤制备的：1)将充分混匀后的羧基磁珠浓缩液放入反应瓶中，将该反应瓶在磁场内放置15～20min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清，向反应瓶中加入相当于反应瓶中羧基磁珠体积2～5倍的磁微粒缓冲液，震荡清洗20～30min；再将反应瓶置于磁场中15～20min后吸去上清；重复清洗羧基磁珠3遍；最后将羧基磁珠溶液定容到10～50mg/mL，混匀待用；2)连接反应按照质量比羧基磁珠溶液：抗异硫氰酸荧光素抗体＝100:1的比例在步骤1)所制得的羧基磁珠溶液中加入抗异硫氰酸荧光素抗体，在2～8℃内保持混匀状态反应18小时；3)反应瓶在磁场中放置15min，待羧基磁珠沉降后用磁微粒缓冲液洗3遍，随后定容至10mg/mL，2～8℃保存，制得所需待用磁微粒试剂。优选的，所述磁微粒缓冲液的配置方法是将12.12～15.26mg的Tris，5.82～8.58mg的氯化钠，50～60g的甲基纤维醚加入到1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解即得。进一步的，所述发光底物是用相当于ALPS体积4～10倍的发光底物缓冲液充分溶解ALPS制备而成的；所述发光底物缓冲液的配置方法是将12.12g～121.14g的Tris、5.82g的氯化钠、0.03g的光泽精加入到1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，用盐酸调节pH至9.5即得。采用该试剂盒测定可溶性生长刺激表达基因2蛋白含量的方法，包括以下步骤：1)取三支试管分别加100μL校准品、100μL质控品、100μL待测样本；2)每支试管中加入60μL抗试剂，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，置于37℃下水浴15min；3)每支试管中加入30μL磁微粒试剂，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，置37℃下水浴5min；4)将试管在磁分离器上沉淀3min，缓慢地倒转试管和磁分离器，倒出上清液；把倒转的试管连同磁分离器一起，放在滤纸上，拍击磁分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；5)每支试管中加入300μL清洗液，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，混匀后缓慢的倒转试管和磁分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同磁分离器一起，放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；6)重复步骤5)一次；7)每支试管中加入200μL发光底物，振荡混匀3s，用化学发光仪检测发光强度。本专利技术的磁微粒试剂是磁微粒与羊抗FITC连接物，含BSA的缓冲液。本专利技术的校准品是分别添加了不同量可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗原的含BSA的缓冲液。本专利技术的技术原理为：异硫氰酸荧光素(FITC)标记的ST2抗体与碱性磷酸酶(AP)标记的ST2配对抗体和样本、校准品或质控品中的ST2结合形成“三明治”复合物。随后加入连有抗FITC抗体的磁微粒，通过抗FITC抗体与FITC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测定可溶性生长刺激表达基因2蛋白含量的试剂盒，其特征在于，包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物；所述磁微粒试剂是将抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制成，所述发光底物是将ALPS溶解于发光底物缓冲液中制成；分别配制校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物；将校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物，独立地置于包装容器内，得到可溶性生长刺激表达基因2蛋白的定量测定试剂盒；(一)、所述校准品、质控品的配制，包括以下步骤：用校准品缓冲溶液溶解可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗原，配制抗试剂的校准品和质控品；其中，所述校准品缓冲溶液是通过在1L的新生牛血清中加入0.01g～0.05g的四环素和0.1g～0.5g的硫酸新霉素，完全溶解后经过0.22μm滤膜处理制备而成；(二)、所述抗试剂的配制：1)抗试剂缓冲液的制备：将10g～20g的Na2PO3H·12H2O、1～2g的NaPO3H2·12H2O、1g～5g的绵羊血清、3g～10g的新生牛血清、1g～5g的马血清加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，用4M HCl调节pH至5～6，制得所述抗试剂缓冲液；2)异硫氰酸荧光素与可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体偶联，获得异硫氰酸荧光素标记的可溶性生长刺激表达基因2蛋白包被抗体：首先用缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液，然后按照可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体：异硫氰酸荧光素溶液＝1:1.1～1:1.5的质量比将二者转移到棕色玻璃瓶里，充分混匀；充分反应后使用pH为8～9的碳酸盐缓冲液平衡，然后使用凝胶层析分离纯化得到异硫氰酸荧光素标记的可溶性生长刺激表达基因2蛋白包被抗体；3)碱性磷酸酶与可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体偶联，获得碱性磷酸酶标记的可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体：首先用缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液，可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体和碱性磷酸酶分别将反应基团分别活化后按照摩尔比为碱性磷酸酶：可溶性生长刺激表达基因2蛋白＝1:1～1:3的反应比在催化剂的催化下充分混匀进行偶联反应，充分反应后，使用pH为8～9的tris缓冲液平衡，凝胶柱进行不同分子大小片度的分离纯化，得到碱性磷酸酶标记的可溶性生长刺激表达基因2蛋白标记抗体；将步骤2)中获得的异硫氰酸荧光素标记的可溶性生长刺激表达基因2蛋白包被抗体和步骤3)中获得的碱性磷酸酶标记的可溶性生长刺激表达基因2蛋白标记抗体加入含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液中，充分搅拌后获得所述抗试剂。...
【技术特征摘要】
1.一种测定可溶性生长刺激表达基因2蛋白含量的试剂盒，其特征在于，包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物；所述磁微粒试剂是将抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制成，所述发光底物是将ALPS溶解于发光底物缓冲液中制成；分别配制校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物；将校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物，独立地置于包装容器内，得到可溶性生长刺激表达基因2蛋白的定量测定试剂盒；(一)、所述校准品、质控品的配制，包括以下步骤：用校准品缓冲溶液溶解可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗原，配制抗试剂的校准品和质控品；其中，所述校准品缓冲溶液是通过在1L的新生牛血清中加入0.01g～0.05g的四环素和0.1g～0.5g的硫酸新霉素，完全溶解后经过0.22μm滤膜处理制备而成；(二)、所述抗试剂的配制：1)抗试剂缓冲液的制备：将10g～20g的Na2PO3H·12H2O、1～2g的NaPO3H2·12H2O、1g～5g的绵羊血清、3g～10g的新生牛血清、1g～5g的马血清加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，用4MHCl调节pH至5～6，制得所述抗试剂缓冲液；2)异硫氰酸荧光素与可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体偶联，获得异硫氰酸荧光素标记的可溶性生长刺激表达基因2蛋白包被抗体：首先用缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液，然后按照可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体：异硫氰酸荧光素溶液＝1:1.1～1:1.5的质量比将二者转移到棕色玻璃瓶里，充分混匀；充分反应后使用pH为8～9的碳酸盐缓冲液平衡，然后使用凝胶层析分离纯化得到异硫氰酸荧光素标记的可溶性生长刺激表达基因2蛋白包被抗体；3)碱性磷酸酶与可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体偶联，获得碱性磷酸酶标记的可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体：首先用缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液，可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体和碱性磷酸酶分别将反应基团分别活化后按照摩尔比为碱性磷酸酶：可溶性生长刺激表达基因2蛋白＝1:1～1:3的反应比在催化剂的催化下充分混匀进行偶联反应，充分反应后，使用pH为8～9的tris缓冲液平衡，凝胶柱进行不同分子大小片度的分离纯化，得到碱性磷酸酶标记的可溶性生长刺激表达基因2蛋白标记抗体；将步骤2)中获得的异硫氰酸荧光素标记的可溶性生长刺激表达基因2蛋白包被抗体和步骤3)中获得的碱性磷酸酶标记的可溶性生长刺激表达基因2蛋白标记抗体加入含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液中，充分搅拌后获得所述抗试剂。2.根据权利要求1所述的测定可溶性生长刺激表达基因2蛋白含量的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括清洗液，所述清洗液的配置方法将将160gNaCl、4gKCl、24.2g三羟甲基氨基甲烷、1mL吐温20溶于900ml双蒸水中，用HCL调整至PH7.4，用双蒸水定容至1000ml。3.根据权...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨旻，刘振世，张誉严，
申请(专利权)人：泰州泽成生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。