一种基于微流控芯片体外糖尿病肾小球模型的构建方法技术

本发明专利技术提供一种基于微流控芯片体外糖尿病肾小球模型的构建方法，该微流控芯片主要由该微流控芯片主要由上下两层PDMS粘合封接而成，由细胞入口池，胶原入口池，培养基入口池，废液池，细胞培养室，培养基灌流室，细胞球捕获槽，细胞迁移室组成；该芯片上添加高糖10～30mM葡萄糖及1～5mM葡萄糖低糖条件的流体培养刺激，侧通道灌流48h形成肾小球滤过屏障，主通道不同糖浓度培养基灌流96h建立体外糖尿病肾小球模型，基于该微流控芯片的糖尿病肾小球模型的不仅可以建立肾小球滤过屏障，对肾小球滤过率进行定时监测，并具有对肾小球内不同组成细胞运动实时追踪的特点，同时能够实现对细胞运动之初的准确定位。

A method for constructing diabetic glomerulus model based on microfluidic chip in vitro

The invention provides a method for the construction of an in vitro diabetic glomerular model based on microfluidic chips. The microfluidic chip mainly consists of the microfluidic chip mainly composed of the upper and lower two layers of PDMS adhesion, which consists of the cell entrance pool, the collagen entrance pool, the culture medium entrance pool, the waste liquid pool, cell culture room, the culture medium perfusion chamber, and the cells. The ball trapping slot and cell migration chamber consist of the fluid culture stimulation with high glucose 10 ~ 30mM glucose and 1 ~ 5mM glucose low glucose conditions. The side channel perfusion 48h forms the glomerular filtration barrier, and the main channel has different glucose concentration medium perfusion 96h to establish the diabetic renal small ball model in vitro, based on the microfluidic microchip diabetes. The disease glomerular model can not only establish glomerular filtration barrier, monitor glomerular filtration rate regularly, but also have the characteristics of real-time tracking of different cells in the glomerulus, and can achieve accurate location of cell movement at the same time.

【技术实现步骤摘要】
一种基于微流控芯片体外糖尿病肾小球模型的构建方法
本专利技术涉及将微流控芯片技术应用到体外构建疾病模型的
，具体涉及一一种基于微流控芯片体外糖尿病肾小球模型的构建方法。
技术介绍
糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)为糖尿病主要的微血管并发症，主要指糖尿病性肾小球硬化症，一种以血管损害为主的肾小球病变。DN不仅给患者本人及其家属带来极大的痛苦,而且也给家庭、医疗系统以及整个社会带来沉重的经济负担。目前对于糖尿病肾病末期尚未出现有效治疗手段。因此，DN的早期或非临床期建立有效治疗模式，逆转肾损伤是DN临床治疗的关键。大量DN研究基于体外细胞培养或者体内动物实验，不能有效研究疾病机理和药物筛选。所以，成功构建糖尿病肾病脑内微环境的体外模型，对于疾病机制研究以及药物筛选尤为关键。为攻克困扰人类已久的糖尿病肾病，如何有效快速的建立良好的肾小球实验模型对糖尿病肾病乃至相关疾病研究十分重要，目前多数研究所采用的动物实验昂贵耗时和常规二维培养仿真性差，这里我们依托微流控芯片技术平台进行糖尿病肾病的肾小球模型建立。微流控芯片技术作为一门迅速发展起来的科学技术，已经在生物医学领域展现了其独特的优势，更因其同细胞尺寸匹配、环境同生理环境相近、在时间和空间维度上能够提供更为精确的操控，易于通过灵活设计实现多种细胞功能研究等特点而成为新一代细胞研究的重要平台。因其高通量，低消耗，设计尺寸相匹，可将依托动物实验的肾小球消耗量大大降低从而简约成本。对流体的精准操控，更近体内真实环境，而应用微流控芯片技术及肾小球微组织，直接建立体外糖尿病肾病的研究尚属于空白领域。
技术实现思路
本专利技术的目的提供一种基于微流控芯片体外糖尿病肾小球模型的构建方法，基于该微流控芯片的糖尿病肾小球模型的不仅可以建立肾小球滤过屏障，对肾小球滤过率进行定时监测，并具有对肾小球内不同组成细胞生物行为及形态变化进行追踪观察。本专利技术提供的微流控芯片，该微流控芯片由上下两层PDMS粘合封接而成，包括细胞入口池，胶原入口池，培养基入口池，废液池，细胞培养室，培养基灌流室，细胞球捕获槽，细胞迁移室；细胞迁移室两端为胶原入口池，中间部分为“丰”字形，中间的横向结构为对称排列着的7～10个细胞球捕获槽，细胞迁移室通过一边的细胞球捕获槽与培养基灌流室连接，细胞迁移室通过另一边的细胞球捕获槽与细胞培养室连接；细胞培养室上连细胞入口池，下连废液池；培养基灌流室为C型，一端为培养基入口池，另一端为废液池。本专利技术提供的微流控芯片，所述微流控芯片细胞迁移室与细胞培养室的交界面为半球形。本专利技术提供的微流控芯片，所述微流控芯片是由高度不同的两部分组成，细胞培养室高度为200-1000μm，胶原入口池和细胞迁移室高度为100-300μm。本专利技术提供了一种基于微流控芯片体外糖尿病肾小球模型的构建方法，具体过程如下：(1)芯片胶原灌注冰上操作，matrigel胶原浓度为工作液，用移液器将Matrigel胶原工作液加入胶原入口池，每孔3μl；加1mlPBS缓冲液于培养皿中，将固定芯片的培养皿放入培养箱中孵育5min或室温放置10分钟凝胶，凝胶过程结束后，从细胞入口池、胶原入口池分别顺序加入细胞培养液；(2)芯片细胞球接种及培养将提取的原代大鼠肾小球微组织细胞球制成悬液，取10μl悬液加入细胞入口池，并迅速从废液池吸走10μl细胞培养液，将芯片竖立，并移入37℃培养箱中放置；竖立方向为细胞培养室朝上，而细胞迁移室朝下；竖立放置10min后，取出观察，细胞球紧贴在细胞培养室与迁移室的交汇处将芯片放平移入37℃培养箱中培养、培养48h,每隔24h换液一次，并拍照记录肾小球细胞贴附Matrigel胶原界面所在位置；肾小球毛细血管壁构成主要为内皮细胞、脏层上皮细胞(足细胞)及内皮主导形成的基底膜构成。体外对肾小球模拟也同样应该具备以上构成。在芯片结构上灌注Matrigel形成三维基质，配合接种和培养肾小球，侧立凹槽内捕获肾小球贴Matrigel爬出内皮细胞和足细胞，可模拟主通道为血流界面的肾小球滤过屏障。依据不同实验处理观察各种细胞对各种细胞在三维微环境中的存活、黏附和增殖等行为进行讨论。(3)芯片构建的肾小球滤过功能评价方法经48小时静止培养，肾小球细胞重新排列于胶原的半弧形界面，形成肾小球滤过屏障，分别用红色，绿色荧光标记的IgG通入细胞培养室和相连培养基通道，对肾小球蛋白的渗透性进行表征，(4)高糖条件培养肾小球细胞待肾小球细胞芯片上静止培养48h后，向细胞培养室添加三个葡萄糖浓度条件培养基：正常培养基组，5mM葡萄糖组，30mM葡萄糖组，培养基流速均为150μl/h，37℃培养箱中培养，每隔24h并拍照记录肾小球细胞贴附Matrigel胶原界面所在位置及细胞迁移室位置。构建结构和功能与生理环境更加接近的肾小球微环境是本项目的关键内容。这部分工作将建立在成功构建肾小球血管壁和肾小球内皮细胞和上足细胞3D共培养体系基础上。在芯片中主通道，以模拟血流环境，并提供营养物质与代谢废物交换；在此基础上，在细胞培养通道中流体中加入高糖因素模拟糖尿病肾病肾小球微环境环境；(5)芯片细胞迁移实时监测采用活细胞工作站CO2显微载物台培养箱进行细胞长期观察，每隔60min拍照一张，实时记录细胞运动位置及形态改变。本专利技术建立的体外糖尿病肾小球模型，肾小球滤过屏障有两种细胞成分肾小球内皮细胞和足细胞构成。本专利技术提供的体外肾小球模型具有能够良好模拟出的生理条件下的肾小球滤过功能。本专利技术提供了一种可以利用含有交给高浓度葡萄糖的培养基来建立糖尿病肾病病理下肾小球模型。本专利技术提供了一种直接观察糖尿病肾病条件下肾小球细胞的动力学研究，观察细胞迁移，及迁移过程中蛋白表达，形态变化。本专利技术提供的基于微流控芯片技术的三维肾小球粘附及球内细胞迁移动力学监测方法，所述Marigel胶原，4℃以下时下它是呈粘稠状的液体，当pH＝7，温度达到常温的情况下，5min，即可呈现果冻状的凝胶。本专利技术提供的基于微流控芯片技术的三维糖尿病肾小球模型，可采用生物学上常用的细胞检测手段对迁移运动到胶原中的细胞进行检测，包括细胞死活标记染色、细胞免疫荧光染色、PCR检测、蛋白质检测。本专利技术利用微流控技术，以具有良好生物相容性，透光性的PDMS为芯片材料，设计的装置可横向直接记录和观察细胞迁移行为的芯片，功能完备，操作简单，并且在芯片上可以独立完成各项信号检测，如细胞蛋白表达，细胞因子分泌，细胞增殖，凋亡检测等。附图说明图1本专利技术微流控芯片整体结构示意图，其中，1细胞入口池，2胶原入口池，3培养基入口池，4废液池，5细胞培养室，6培养基灌流室，细7胞球捕获槽，8细胞迁移室，9芯片下层PDMS整体结构，10芯片下层PDMS整体结构。图2原代大鼠肾小球形态表征及内皮细胞和足细胞鉴定；图3原代大鼠肾小球接种后竖立10min时的细胞贴附情况及培养96小时后肾小球滤过屏障形成鉴定；图4肾小球滤过屏障功能鉴定图5不同糖浓度刺激后，芯片上肾小球的生物行为变化。具体实施方式下面的实施例将对本专利技术予以进一步的说明，但并不因此而限制本专利技术。实施例1利用实验室自行设计并制作的微流控芯片，构型如图1所示。芯片由细胞入口池1，胶原入口池2，培养基入口池3，废本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微流控芯片，其特征在于：该微流控芯片由上下两层PDMS粘合封接而成，包括细胞入口池(1)，胶原入口池(2)，培养基入口池(3)，废液池(4)，细胞培养室(5)，培养基灌流室(6)，细胞球捕获槽(7)，细胞迁移室(8)；细胞迁移室(8)两端为胶原入口池(2)，中间部分为“丰”字形，中间的横向结构为对称排列着7～10个细胞球捕获槽(7)，细胞迁移室(8)通过一边的细胞球捕获槽(7)与培养基灌流室(6)连接，细胞迁移室(8)通过另一边的的细胞球捕获槽(7)与细胞培养室(5)连接；细胞培养室(5)上连细胞入口池(1)，下连废液池(4)；培养基灌流室(6)为C型，一端为培养基入口池(3)，另一端为废液池(4)。

【技术特征摘要】
1.一种微流控芯片，其特征在于：该微流控芯片由上下两层PDMS粘合封接而成，包括细胞入口池(1)，胶原入口池(2)，培养基入口池(3)，废液池(4)，细胞培养室(5)，培养基灌流室(6)，细胞球捕获槽(7)，细胞迁移室(8)；细胞迁移室(8)两端为胶原入口池(2)，中间部分为“丰”字形，中间的横向结构为对称排列着7～10个细胞球捕获槽(7)，细胞迁移室(8)通过一边的细胞球捕获槽(7)与培养基灌流室(6)连接，细胞迁移室(8)通过另一边的的细胞球捕获槽(7)与细胞培养室(5)连接；细胞培养室(5)上连细胞入口池(1)，下连废液池(4)；培养基灌流室(6)为C型，一端为培养基入口池(3)，另一端为废液池(4)。2.按照权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片是由高度不同的两部分组成，细胞培养室(4)高度为200-1000μm，胶原入口池(2)和细胞迁移室(5)高度为100-300μm。3.按照权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：细胞捕获槽(7)为半球形，可使使胶原形成凹面。4.一种基于微流控芯片体外糖尿病肾小球模型的构建方法，其特征在于采用上述芯片，按照如下步骤进行：(1)芯片胶原灌注冰上操作，Matrigel胶原为工作液，用移液器将Matrigel胶原工作液加入胶原入口池，每孔3μl；加1mlPBS缓冲液于培养皿中，将固定芯片的培养皿放入培养箱中孵育5min或室温放置10分钟凝胶，凝胶过程结束后，从细胞入口...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦建华，陶婷婷，王丽，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21