一种非对称PCR的试纸条检测植物病原菌的方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种基于共有引物介导的非对称PCR的试纸条检测植物病原菌的方法及试剂盒，属于生物检测技术领域。该方法包括如下步骤：（1）提取植物病原菌的基因组DNA；（2）设计扩增引物；（3）进行非对称PCR反应；（4）设计捕捉探针；（5）制备纳米金探针；（6）制备胶体金核酸试纸条；（7）样品的检测。使用该方法检测致病疫霉的试剂盒包括引物、酶、缓冲液、dNTPs、探针和胶体金核酸试剂条等。本方法将基于共有引物介导的非对称PCR与试纸条检测结合，可以实现定性或者定量检测，成本低、检测速度快、特异性好、灵敏度高、使用安全。

【技术实现步骤摘要】
一种非对称PCR的试纸条检测植物病原菌的方法及试剂盒
本专利技术属于生物检测
，涉及一种基于共有引物介导的非对称PCR的试纸条检测植物病原菌的方法及试剂盒。
技术介绍
我国是农业大国，保障和促进农业的可持续发展一直是国家非常重视的问题。植物病原菌严重危害各种农作物的生长，是现代农业生产的最主要威胁之一。植物病害造成的经济损失是多方面的。首先，对生产者来说，由于病害引起的产量减少和产品质量降低，导致收入减少；由于防治植物病害（比如喷洒农药）所产生的防治费用而增加了成本；有时不得不种植抗病但产量不高的品种或者改种其他经济效益低的作物。其次，对消费者来说，病害引起的减产会导致农产品价格上涨，使他们生活开支增加，生活品质下降。据联合国粮农组织（FAO）估计，植物因受病害损失平均为总产量的10%-15%。全球因此造成的经济损失平均每年高达2000亿美元。因此，无论是病害预测还是病害防治，都亟需发展一种快速、灵敏、特异、安全的检测植物病原菌的方法。对发病植物进行快速准确的病害诊断，对无病状植物材料和植物生长环境中病原物的及时检测和监测是控制植物病害流行和成灾的重要基础。在植物病害检测中，传统的检测方法一般是在植物出现症状以后，通过观察其症状表现，进行病原物的分离等一系列繁琐的过程，最终才得到鉴定结果，而且有一些病原物的分离鉴定比较困难，尤其是大多数专性寄生物难以人工离体培养，这就使得病原物检测和病害诊断过程存在检测周期长、工作量大、结果不准确等缺点。近年来随着分子生物学技术的发展，一些新的检测技术得到了迅速的发展和应用，比如核酸试纸条检测技术，其源于成熟的免疫层析技术。免疫层析技术的原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。核酸试纸条技术的原理则是基于核酸杂交而不是抗原抗体特异性结合，其与免疫试纸条相比，具有成本低、应用范围广、灵敏度高、准确性好的特点，因而已被应用于转基因生物的检测、细菌感染的分子诊断和基因分型等领域，同时在控制植物病害的传播、成灾中也发挥了重要作用。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于共有引物介导的非对称PCR与核酸试纸条检测结合的快速、灵敏、准确、操作简便的检测植物病原菌的方法。本专利技术的另一目的在于提供一种使用上述方法检测致病疫霉的试剂盒。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：基于共有引物介导的非对称PCR结合核酸试纸条检测植物病原菌的方法，具体包括以下步骤：（1）模板的准备：提取植物病原菌的DNA。（2）设计扩增引物：包括一条共有引物以及一对能够特异地扩增植物病原菌保守序列的上游引物和下游引物。共有引物为与植物病原菌基因组不能完全互补配对的一段序列。上游引物的5’端添加了一段与共有引物序列相同的序列。（3）非对称PCR反应：将步骤（1）制备的模板、步骤（2）设计合成的引物进行非对称PCR扩增反应，得到单链DNA产物。（4）探针的设计：根据单链DNA产物的序列设计三条捕捉探针，探针1和探针2分别和单链DNA产物的两端互补，探针3与探针1完全互补；三条探针的一端都修饰有功能基团。（5）纳米金探针的制备：将步骤（4）中所设计合成的探针1与纳米金连接制备纳米金探针，并用包埋缓冲液重悬纳米金探针得到用于包埋的纳米金探针。（6）胶体金核酸试纸条的制备胶体金核酸试纸条由底板、样品板、金垫、硝酸纤维素膜（NC膜）和吸水板构成，将样品板、金垫、硝酸纤维素膜（NC膜）和吸水板依次搭接固定于底板上（如图1B所示结构）组装得到胶体金核酸试纸条。所述的金垫包埋有步骤（5）制备的纳米金探针；所述的硝酸纤维素膜上有含链霉亲和素和探针3的控制线（C线）和含链霉亲和素和探针2的检测线（T线），检测线靠近金垫，控制线靠近吸水板。（7）检测：将由步骤（3）得到的DNA产物与检测缓冲液（4×柠檬酸钠缓冲液+5%甲酰胺+1%TritonX-100）混合，混合液滴加到胶体金核酸试纸条的样品板上，再滴加检测缓冲液，读取结果，检测线和控制线都变成红色表明有靶序列存在，即有待测植物病原菌，仅有控制线变成红色表明没有待测植物病原菌。步骤（1）中所述植物病原菌包括致病疫霉（Phytophthorainfestans）、立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani）、茄科雷尔氏菌（Ralstoniasolanacearum）、稻瘟菌（Magnaporthegrisea）、玉米锈病菌（PucciniasorghiSchw.）、小麦壳针孢叶枯病菌（Zymoseptoriatritici）、柑桔溃疡病菌（Xanthomonasaxonopodispv.citri,Xac）和马铃薯早疫病菌（Alternariasolani）等。步骤（2）中所述植物病原菌保守序列优选为植物病原菌的16S核糖体RNA基因（16SrRNA基因）保守区、基因组重复序列或毒力基因片段，如致病疫霉O8重复序列、立枯丝核菌的内毒素ENDO1基因和稻瘟菌的16SrRNA基因等。步骤（3）中所述非对称PCR反应的体系包含：模板DNA、聚合酶、聚合酶缓冲液、共有引物、上游引物、下游引物、dNTPs和双蒸水；所述的共有引物的终浓度为300～500nM；所述的上游引物的终浓度为30～60nM；所述的下游引物的终浓度为30～60nM。步骤（3）所述非对称PCR反应的条件优选为每25μL反应体系的组成如下：模板DNA1ng/μL、共有引物300nM，上游引物30nM、下游引物30nM、聚合酶0.5U、聚合酶缓冲液、dNTPs0.1mM（每种脱氧核糖核苷三磷酸的浓度为0.1mM）；步骤（3）所述扩增过程优选为：95℃反应3min；接着95℃反应30s，52℃反应30s，72℃反应30s，共反应45个循环；72℃反应10min。步骤（3）中所述单链DNA产物的长度优选为100～300nt。步骤（4）中所述探针1和探针2的长度优选为20～30nt。步骤（4）中所述探针1的功能基团优选为巯基，探针2和探针3的功能基团优选为生物素。步骤（5）中所述纳米金的粒径优选为13-20nm。步骤（5）中所述包埋缓冲液为：Na3PO420mM，BSA（牛血清白蛋白）质量百分比5%，Tween20体积百分比0.25%，蔗糖质量百分比10%。步骤（6）中所述的底板的材料优选为PVC塑料。步骤（6）中所述样品板的材料优选为玻璃纤维，其处理方法为：用样品板处理缓冲液浸润，置于干燥器中室温保存；所述样品板处理缓冲液为：pH8.0，体积百分比0.25%的TritonX-100，0.05MTris-HCl，0.15MNaCl。步骤（6）中所述金垫的材料优选为玻璃纤维，其处理方法为：用20μL步骤（5）中所述的用于包埋的纳米金探针喷在其上，室温下干燥，干燥器中4℃保存。步骤（6）中所述硝酸纤维素膜的处理方法优选为：用喷膜仪将5μL链霉亲和素溶液和探针2混合液喷到检测线（T线）的位置，将5μL链霉亲和素溶液和探针3混合液喷到控制线（C线）的位置，置于室温下干燥本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于共有引物介导的非对称PCR的试纸条检测植物病原菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）模板的准备：提取植物病原菌的DNA；（2）设计成三条用于扩增植物病原菌保守序列的引物：共有引物、上游引物和下游引物，上游引物的5’端添加上共有引物的序列；（3）非对称PCR反应：将步骤（1）制备的模板、步骤（2）设计合成的引物进行非对称PCR扩增反应，得到单链DNA产物；（4）探针的设计：根据单链DNA产物的序列设计三条捕捉探针，探针1和探针2分别和单链DNA产物的两端互补，探针3与探针1完全互补；三条探针的一端都修饰有功能基团；（5）纳米金探针的制备：将步骤（4）中所设计合成的探针1与纳米金连接制备纳米金探针，并用包埋缓冲液重悬纳米金探针得到用于包埋的纳米金探针；（6）胶体金核酸试纸条的制备胶体金核酸试纸条由底板、样品板、金垫、硝酸纤维素膜和吸水板构成，将样品板、金垫、硝酸纤维素膜和吸水板依次搭接固定于底板上组装得到胶体金核酸试纸条；所述的金垫包埋有步骤（5）制备的纳米金探针；所述的硝酸纤维素膜上有含链霉亲和素和探针3的控制线和含链霉亲和素和探针2的检测线；（7）检测：将由步骤（3）得到的DNA产物与检测缓冲液混合，混合液滴加到胶体金核酸试纸条的样品板上，再滴加检测缓冲液，读取结果，检测线和控制线都变成红色表明有靶序列存在，即有待测植物病原菌，仅有控制线变成红色表明没有待测植物病原菌。...

【技术特征摘要】
1.一种基于共有引物介导的非对称PCR的试纸条检测植物病原菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）模板的准备：提取植物病原菌的DNA；（2）设计成三条用于扩增植物病原菌保守序列的引物：共有引物、上游引物和下游引物，上游引物的5’端添加上共有引物的序列；（3）非对称PCR反应：将步骤（1）制备的模板、步骤（2）设计合成的引物进行非对称PCR扩增反应，得到单链DNA产物；（4）探针的设计：根据单链DNA产物的序列设计三条捕捉探针，探针1和探针2分别和单链DNA产物的两端互补，探针3与探针1完全互补；三条探针的一端都修饰有功能基团；（5）纳米金探针的制备：将步骤（4）中所设计合成的探针1与纳米金连接制备纳米金探针，并用包埋缓冲液重悬纳米金探针得到用于包埋的纳米金探针；（6）胶体金核酸试纸条的制备胶体金核酸试纸条由底板、样品板、金垫、硝酸纤维素膜和吸水板构成，将样品板、金垫、硝酸纤维素膜和吸水板依次搭接固定于底板上组装得到胶体金核酸试纸条；所述的金垫包埋有步骤（5）制备的纳米金探针；所述的硝酸纤维素膜上有含链霉亲和素和探针3的控制线和含链霉亲和素和探针2的检测线；（7）检测：将由步骤（3）得到的DNA产物与检测缓冲液混合，混合液滴加到胶体金核酸试纸条的样品板上，再滴加检测缓冲液，读取结果，检测线和控制线都变成红色表明有靶序列存在，即有待测植物病原菌，仅有控制线变成红色表明没有待测植物病原菌。2.根据权利要求1所述的基于共有引物介导的非对称PCR的试纸条检测植物病原菌的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的植物病原菌包括致病疫霉、立枯丝核菌、茄科雷尔氏菌、稻瘟菌、玉米锈病菌、小麦壳针孢叶枯病菌、柑桔溃疡病菌和马铃薯早疫病菌；步骤（2）中所述的植物病原菌保守序列为植物病原菌的16S核糖体RNA基因保守区、基因组重复序列或毒力基因片段。3.根据权利要求1所述的基于共有引物介导的非对称PCR结合核酸试纸条检测植物病原菌的方法，其特征在于：步骤（3）中所述非对称PCR反应的体系包含：模板DNA、聚合酶、聚合酶缓冲液、共有引物、上游引物、下游引物、dNTPs和双蒸水；所述的共有引物的终浓度为300～500nM；所述的上游引物的终浓度为30～60nM；所述的下游引物的终浓度为30～60nM；所述单链DNA产物的长度为100～300nt。4.根据权利要求1所述的基于共有引物介导的非对称PCR的试纸条检测植物病原菌的方法，其特征在于：步骤（3）所述非对称PCR反应的条件为每25μL反应体系的组成如下：模板DNA1ng/μL、共有引物300nM、上游引物30nM、下游引物30nM、聚合酶0.5U、聚合酶缓冲液、dNTPs0.2mM；扩增过程为：95℃反应3min；接着95℃反应30s，54℃反应30s，72℃反应30s，共反应40个循环；最后72℃反应10min。5.根据权利要求1所述的基于共有引物介导的非对称PCR的试纸条检测植物病原菌的方法，其特征在于：步骤（4）中所述探针1和探针2的长度为20～30nt；所述的探针1的功能基团为巯基，探针2和探针3的功能基团为生物素。6.根据权利要求1所述的基于共有引物介导的非对称PCR的试纸条检测植物病原菌的方法，其特征在于：步骤（5）中所述纳米金的粒径为13-20nm；所述的包埋缓冲液为：Na3PO420mM，BSA质量百分比5%，TweenX-100体积百分比0.25%，蔗糖质量百分比10%。7.根据权利要求1所述的基于共有引物介导的非对称PCR的试纸条检测植物病原菌的方法，其特征在于：步骤（6）中所述底板的材料为PVC塑料；所述的样品板的材料为玻璃...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹芳芳，詹家绥，王甜，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建,35