高寒牧区裹包青贮用混合乳酸菌制剂制造技术

本发明专利技术公开了一种高寒牧区裹包青贮用混合乳酸菌制剂，它由保藏编号为CGMCC No.14117的植物乳杆菌，保藏编号为CGMCC No.14116的副干酪乳杆菌，保藏编号为CGMCC No.14183的耐乙醇片球菌组成。使用该混合乳酸菌制剂后青贮饲料乳酸和总酸含量大于它们单独使用及现有市售产品，pH值、有害微生物数量、丙酸含量、氨态氮/总氮比值低于它们单独使用及现有市售产品；有氧稳定性提高，进一步改善青贮饲料发酵品质，提高青贮饲料粗蛋白含量和体外干物质消化率，可将青贮调制延长至8月中旬。

Mixed lactic acid bacteria preparation for enveloped silage in high and cold pastoral area

The invention discloses a mixture of lactic acid bacteria in alpine pastoral areas in preparation of encapsulated silage, it consists of the preservation number of Lactobacillus plantarum CGMCC No.14117, the preservation number is CGMCC No.14116 L.paracasei, the preservation number is CGMCC No.14183 aureus resistant to ethanol. Using the mixed lactic acid bacteria after silage lactic acid and total acid content greater than they were used alone and existing commercial products, pH value, harmful microorganisms, propionic acid, ammonia nitrogen / total nitrogen were lower than they were used alone and existing commercial products; improving aerobic stability, further improve the quality of silage, improve silage crude protein content and in vitro digestibility of dry matter, can be extended to mid August ensiling.

【技术实现步骤摘要】
高寒牧区裹包青贮用混合乳酸菌制剂
本专利技术属于畜牧业领域，具体涉及一种高寒牧区裹包青贮用混合乳酸菌制剂。
技术介绍
随着畜牧业的发展，乳酸菌制剂在青贮饲料中应用越来越广泛。大量研究表明，乳酸菌添加效果因代谢类型、原料特性和气候环境的不同而有所差异。冷凉地区饲草附着乳酸菌数量和组成不同于温带地区和热带地区。目前使用的商业乳酸菌主要来源于温带环境，同时有部分研究旨在筛选热带地区适应青贮调制的优势乳酸菌。裹包青贮饲料的保存与大部分常规青贮饲料保存方式相似，但裹包青贮饲料的营养成分和微生物组成与常规青贮不一致。相对于常规青贮，裹包青贮料开启乳酸菌发酵较晚，发酵酸浓度较低，pH值降低速率较慢，使得裹包青贮料易于感染有害微生物。小型裹包青贮能够使养殖数量较少的农牧民从事青贮饲料生产，无需投入大量资金进行青贮设施修筑和机械设备购买，但很多因素也影响裹包青贮饲料的发酵品质和营养成分，包括原料特性、包膜质地、贮存管理等。由于川西北高寒牧区特殊的气候环境，小型裹包青贮能够确保农牧民根据饲草品质、牲畜数量来合理进行饲草保存。在青贮饲料生产过程中，低温往往抑制乳酸菌发酵，增加青贮损失。目前，已通过添加有机酸(甲酸、乙酸和丙酸)、提前饲草物候期、适时萎蔫等相应措施来提高青贮饲料品质，但这些措施均有一定的局限性。添加乳酸菌能够提高裹包青贮饲料品质和动物生产性能。通过筛选适合高寒牧区裹包青贮用的乳酸菌，促进青贮初期乳酸菌发酵，快速产生乳酸，使青贮体快速形成酸性环境，减少青贮损失。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题为：如何提供一种适合于高寒牧区裹包青贮用的乳酸菌制剂。本专利技术的技术方案为：高寒牧区裹包青贮用混合乳酸菌制剂，它由保藏编号为CGMCCNo.14117的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)148，保藏编号为CGMCCNo.14116的副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)171和保藏编号为CGMCCNo.14183的耐乙醇片球菌(Pediococcusethanolidurans)P-14组成。植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)148简称为菌株148，副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)171简称为菌株171，耐乙醇片球菌(Pediococcusethanolidurans)P-14简称为菌株P-14。植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)148于2017年5月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14117，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)171于2017年5月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14116，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。耐乙醇片球菌(Pediococcusethanolidurans)P-14于2017年5月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14183，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的菌株P-14、菌株148和菌株171的最适生长温度为15℃，具有生长速度快、产酸多等特征，为青贮调制提供有利条件，能够在低温条件下快速完成发酵(≤20d)，增加乳酸和总酸含量，降低pH值、氨态氮/总氮比值、丙酸和丁酸含量，改善青贮饲料发酵品质，提高青贮饲料粗蛋白含量和体外干物质消化率，可在青贮调制过程中作为添加剂使用。将它们3株菌制成混合乳酸菌制剂后使用，青贮饲料乳酸和总酸含量大于它们单独使用及现有市售产品，pH值、有害微生物数量、丙酸含量、氨态氮/总氮比值低于它们单独使用及现有市售产品；有氧稳定性提高，进一步改善青贮饲料发酵品质，提高青贮饲料粗蛋白含量和体外干物质消化率，可将青贮调制延长至8月中旬。附图说明图1接种菌株绿汁液发酵48h后的pH值和菌体吸光度(OD600)；图2接种乳酸菌株后绿汁发酵液OD600曲线；图3接种乳酸菌株后绿汁发酵液pH曲线；图4接种菌株绿汁液发酵48h后的乳酸、乙酸、丙酸和乙醇含量；图5接种乳酸菌株后绿汁发酵液乳酸曲线；图6温度对接种乳酸菌绿汁发酵液pH值的影响(48h)；图7参考乳酸菌PCR扩增片段电泳图谱；图8所筛选乳酸菌PCR扩增片段电泳图谱；图9乳酸菌对青贮饲料pH值的影响；图10乳酸菌对青贮饲料乳酸含量的影响；图11低温乳酸菌对青贮饲料氨态氮/总氮比值的影响；图12乳酸菌对裹包青贮饲料有氧稳定性的影响。具体实施方式1材料与方法1.1乳酸菌的分离采集川西北高寒牧区天然青贮饲料(老芒麦、燕麦)样本共计86份，无菌镊子夹入无菌自封袋中，密封，车载冰箱运回实验室，-80℃低温保藏备用。将冰冻样品置于超净工作台室温解冻，取5g样品于250mL无菌三角瓶中，加入45mL0.9％无菌生理盐水，保鲜膜封口，震荡2～3h，用无菌纱布过滤，取滤液1m进行梯度稀释，分别取10-3、10-4、10-5稀释度样品液1mL涂布于无菌培养基中。每个稀释度涂布3～5个平板(Φ10cm)。培养基分别为MRS培养基、CaCO3+MRS复合培养基、M17培养基和GYP培养基(所有培养基由成都力天世纪科技有限公司提供，下同)。采用厌氧培养箱培养，培养温度为15℃，时间48-96h。选择乳白色、黄色或者具有溶盖圈的菌落进行多次纯化，通过革兰氏染色(阳性)、过氧化氢酶反应(阴性)初步鉴定为乳酸菌(127株)。根据伯爵仕手册，通过菌落形态、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、H2S产气试验、吲哚试验、葡萄糖产酸产气试验、碳水化合物发酵产酸试验等(所有生化管和鉴定管由成都力天世纪生物科技有限公司提供)，归类为44株乳酸菌。根据初步筛选出的菌株再次纯化后于MRSbroth/M17broth+甘油-20℃冰箱保藏备用。1.2乳酸菌的筛选及接种后绿汁发酵液特性将拔节期青贮玉米(或花期苜蓿)榨汁，用无菌纱布过滤，收集滤液作为绿汁发酵液评价筛选出的乳酸菌pH和发酵产物组成(乳酸、乙酸、丙酸和丁酸)。绿汁发酵液4500r/min离心后取上清液，加入2％蔗糖，搅拌均匀。将保存的菌株从超低温冰箱中取出后接种于MRSbroth或者M17broth中进行活化，5％(v/v)接种量逐步扩大培养，通过分光光度计调整菌悬液同一吸光度，之后再按照5％(v/v)接种量接种于绿汁发酵液中，15℃厌氧培养箱中分别培养3、6、12、24、48h。同时，分别接种不同菌株于绿汁发酵液中，在不同温度(5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃)下培养48h。采用梅特勒酸度计(A20，上海阔思电子有限公司)测定绿汁发酵液pH值；采用分光光度计(ShimadzumodelUV-2501；ShimadzuCorp.,Tokyo,Japan)测定绿汁发酵液吸光度(OD600)；培养48h的绿汁发酵液发酵液10000r/min低温(4℃)离心后采用第一章1.4的方法测定乳酸和挥发性脂肪酸，并且通过高效液相色谱(S本文档来自技高网...

【技术保护点】
高寒牧区裹包青贮用混合乳酸菌制剂，其特征在于，它由保藏编号为CGMCC No.14117的植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)148，保藏编号为CGMCC No.14116的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)171和保藏编号为CGMCC No.14183的耐乙醇片球菌(Pediococcus ethanolidurans)P‑14组成。

【技术特征摘要】
1.高寒牧区裹包青贮用混合乳酸菌制剂，其特征在于，它由保藏编号为CGMCCNo.14117的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)148，保藏编号为CGMCCNo.14116的副干酪乳杆菌(Lactobaci...

【专利技术属性】
技术研发人员：李平，白史且，沈益新，李达旭，游明鸿，张玉，苟文龙，
申请(专利权)人：四川省草原科学研究院，
类型：发明
国别省市：四川,51