本发明专利技术公开了一种人白细胞介素－１２在银纹夜蛾中的表达及其纯化的方法，其特征在于通过血腔注射ＡｃＮＰＶ－ｈＩＬ１２感染银纹夜蛾幼虫，９６ｈ后，用７５％酒精消毒银纹夜蛾幼虫，消毒针刺破头部，收集血淋巴于灭菌管中。重组杆状病毒ＡｃＮＰＶ－ｈＩＬ１２经血腔感染银纹夜蛾幼虫９６ｈ，血淋巴经１００，０００ｇ离心３０ｍｉｎ，收集上清。将人白细胞介素－１２ｍＡｂ偶联于ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－４Ｂ上，采用ｈＩＬ－１２ｍＡｂＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－４Ｂ柱免疫亲和层析纯化ｈＩＬ－１２。本发明专利技术方法操作方便，所获得的人白细胞介素－１２适用于肿瘤、细菌、病毒和寄生虫等感染性疾病的治疗。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种人白细胞介素-12在银纹夜蛾中的表达，具体地说，本专利技术涉及利用含有人白细胞介素-12基因的重组昆虫病毒株在银纹夜蛾幼虫活体中高效表达人白细胞介素-12，同时本专利技术还涉及一种人白细胞介素-12纯化的方法。
技术介绍
人白细胞介素-12(human lnterlukin12，hIL-12)是人体的重要细胞因子，也称之为自然杀伤细胞刺激因子(NKSF)或细胞毒性淋巴成熟因子(CLMF)。1989年，Kobayashi等先分离并纯化hIL-12(Kobayashi M，et a1.J Exp Med，1989ml70827-845)。1991年，Gubler和Wolf克隆了hIL-12 cDNA全序列，并在哺乳动物细胞中表达(Gubler U，et al，Proc Nati Acad Sci USA，1991，884143-4147；Wolf S F，et al，J Immunol，1991，1463047-3081)。hIL-12是由不具基因相关性的两个蛋白质亚基P35和P40通过二硫键相连构成一个70KDa的糖蛋白异二聚体。P35亚基有197个氨基酸残基，分子量为31KDa；P40亚基有306个氨基酸残基，分子量为40KDa。P35亚基是传递信息的功能亚单位(Gubler，at al.JBiol Chem，1995，27011)而P40亚基是hIL-12与细胞受体结合的功能蛋白质(Gillessen S，et al European Journal of Immunology，1995，251)。IL-12主要是由抗原提呈细胞产生的一种异二聚体细胞因子，能显著增强NK/LAK细胞的杀伤活性，促进特异性CTL细胞的启答能力，诱导T细胞和NK细胞大量分泌IFN-γ，启动TH0细胞向TH1细胞的发育，在抗病毒、抗肿瘤、抗细胞内寄生菌感染、艾滋病等多种疾病中将发挥重要作用。(Lamont AG，et al，lmmunology Today，1996，17214-217)。国内外学者(杨林等，微生物学报，2001，41(1)35-41，魏海明等，中华微生物学和免疫学杂志，2000，20(6)584-587，Kazuaki Takehara et al VeterinaryImmunology and Immunopathology，2000，7715-25)利用昆虫病毒双表达载体共表达白细胞介素12双亚基，或者分别表达P35、P40亚基(沈惠等，生物工程学报，1998，14(4)360-364)。或者利用腺病毒载体的E1和E3缺陷区，分别将P40和P35克隆到E1和E3缺陷区进行表达(章卫平等，中华医学杂志，1998，78(1)33-36；中国专利CN98126748.3，申请日1998年12月13日)，并将能表达hIL-12的病毒应用于治疗。白细胞介素-12是目前所发现的细胞因子中对体内免疫活性细胞诱导调节作用最强且范围最广的一种细胞因子，参与抗体的抗肿瘤、抗过敏、抗感染过程。目前，美国已将IL-12用于治疗艾滋患者和肿瘤患者，现已进临床III期。IL-12用于抗利什曼原虫、抗疟原虫、抗结核病、抗血吸虫病也已进入动物实验。1997年，Michael Brunda研究组报道，IL-12对多种肿瘤具有明显作用，包括对肾瘤、黑色素瘤，Colon肿瘤和14种亚性肿瘤。在把IL-12用于治疗小鼠16F16黑瘤的模型中，IL-12注射于患瘤鼠，可抑制肿瘤生长；直接把IL-12注射到肿瘤部位导致肿瘤退化，在长期处理后，肿瘤消退，动物治愈。虽然研究表明hIL-12有巨大的应用前景，并且具有许多制备hIL-12的方法，但是hIL-12的使用存在量的问题，过量的使用会引起机体的免疫反应，产生毒性作用。因此，采用基因工程的方法获得hIL-12用于临床治疗，适时适量提供病人，优于基因治疗，并且基因治疗中存在着导入的病毒安全性的问题。另外，尽管有学者分别表达P35、P40亚基，但由于hIL-12中的P35、P40亚基经形成二聚体才具有活性。因此，需P35、P40双亚基共表达。国内外学者(魏海明等，中华微生物学和免疫学杂志，2000，20(6)584-587)也有利用AcNPV系统在昆虫sf细胞中共表达P35和P40双亚基。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种人白细胞介素-12在银纹夜蛾中的表达，利用含有人白细胞介素-12基因的重组昆虫病毒株感染银纹夜蛾幼虫活体，体内高效表达由P35和P40双亚基构成的人白细胞介素-12异二聚体的方法。本专利技术的另一个目的是提供一种制备高纯度人白细胞介素-12的纯化方法。用该方法制备的人白细胞介素-12具有明显的生物活性。为了达到上述目的，本专利技术叙述如下本专利技术所利用的重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒属一株命名为重组AcNPV的毒株AcNPV-hIL12(CCTCC NOV200108)，该株已申请中国专利，专利申请号为01133631.5，一种表达人白细胞介素-12(hIL-12)的重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒株，该重组病毒株插入了人白细胞介素-12表达盒，表达盒包括双启动子序列，人白细胞介素-12的P35亚基DNA编码序列和P40亚基DNA编码序列，P35亚基基因位于Polyhedrin启动子下游，P40亚基基因位于P10 promoter启动子下游。其特征是通过血腔注射AcNPV-hIL12感染银纹夜蛾幼虫，高效表达重组人白细胞介素-12，并经亲和层析纯化获得人白细胞介2素-12。其方法为采取血腔注射4龄银纹夜蛾幼虫第2腹足方法，按2μl1×107pfu/ml AcNPV-hIL12注射1头银纹夜蛾的剂量感染。96h后，用75％酒精消毒银纹夜蛾幼虫，消毒针刺破头部，收集血淋巴于灭菌管中；再将人白细胞介素-12mAb偶联于Sepharose CL-4B上，通过亲和层析法纯化人白细胞介素-12，其具体方法是将hIL-12mAb偶联于Sepharose CL-4B，重组杆状病毒AcNPV-hIL12经血腔感染银纹夜蛾幼虫96h，血淋巴经100,000g离心30min，收集上清。采用hIL-12mAb Sepharose CL-4B柱免疫亲和层析纯化hIL-12。获得有明显生物活性的人白细胞介素-12蛋白。AcNPV-hIL12感染银纹夜蛾幼虫细胞变化AcNPV-hIL12经血腔感染4龄银纹夜蛾幼虫。经包埋，超薄切片、染色，用透射电镜观察。AcNPV-hIL12经血腔注射感染4龄银纹夜蛾幼虫72h，经透射电镜观察表明，感染的中肠细胞和脂肪体细胞有病毒粒子复制。hIL-12的表达和纯化采用10％SDS-PAGE、银染法和Western Blot鉴定。根据R&D公司ECLWestern Bolot操作手册进行。结果表明，AcNPV-hIL12感染的Sf9细胞浓缩上清和感染的银纹夜蛾幼虫血淋巴，有特异性31KDa和40KDa二种蛋白的表达。采用HPLC法检测hIL-12纯度。hIL-12 ELISA检测，根据R&D公司操作手册进行。具体实施例方式hIL-12的表达及纯化(1)hIL-12mAb Sepharose CL-4B的制备根据March等(1974，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人白细胞介素－１２在银纹夜蛾中的表达，其特征在于利用含ｈＩＬ－１２基因的重组昆虫病毒株ＡｃＮＰＶ－ｈＩＬ１２经血腔感染银纹夜蛾，表达和纯化人白细胞介素－１２。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孟小林，徐进平，王健，鲁伟，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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