日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白的基因序列制造技术

本发明专利技术涉及生物基因领域，具体涉及日本血吸虫抱雌沟蛋白的基因序列及在大肠杆菌中的表达。本发明专利技术根据已报道的曼氏血吸虫编码抱雌沟蛋白的基因ＳｍＧｃｐ序列和编码日本血吸虫抱雌沟蛋白保守区的ｃＤＮＡ序列ＳｊＧｃｐ１设计两对引物，分别扩增出日本血吸虫抱雌沟蛋白编码序列的５’和３’区段，再根据测序结果设计编码全长引物，从虫体中抽提总ＲＮＡ，用ＰＣＲ克隆出该基因，克隆后经全序列测定表明该成熟蛋白ｃＤＮＡ编码１９３２个核甘酸，即６４３个氨基酸。该基因的成功克隆及基因序列测定为以后阐明血吸虫的生殖发育机理，以及从阻滞雌虫成熟方面防治血吸虫病打下了良好的基础。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物基因领域，具体涉及日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白的基因序列以及在大肠杆菌中的表达。日本血吸虫抱雌沟蛋白是雄虫特异性表达蛋白质，其表达局限于雄虫抱雌沟(雌雄合抱作用发生部位)表面，是合抱依赖性的，该蛋白质通过雌雄合抱而广泛分布于雌虫体表，其表达产物氨基酸序列于具有发育调节功能的生物分子成束蛋白Fascilin I等有高度同源性，因而推断抱雌沟蛋白具有发育调节功能，在雌雄合抱促进雌虫发育及性成熟方面发挥作用。在亚洲，尤其是中国和菲律宾，引起人畜血吸虫病的主要是日本血吸虫(Schistosoma japonicum)。血吸虫卵是血吸虫病致病和传播的主要原因，且日本血吸虫的雌虫产卵量是曼氏血吸虫和埃及血吸虫雌虫产卵量的10倍，因此从控制血吸虫成熟及生殖着手防治血吸虫病对于我国血吸虫病防治具有更大的意义。本专利技术根据已报道的曼氏血吸虫编码抱雌沟蛋白的基因SmGcp序列和编码日本血吸虫抱雌沟蛋白保守区的cDNA序列SjGcp1设计两对引物，分别扩增出日本血吸虫抱雌沟蛋白编码序列的5’和3’区段，再根据测序结果设计第三对引物，然后从日本血吸虫体中分离有关的mRNA作为模板，经反转录获得cDNA，用PCR方法扩增和克隆了抱雌沟蛋白的完整阅读框，并分析测定其序列；其cDNA5’端序列的获得是以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板，根据已知抱雌沟蛋白基因序列设计一系列下游引物GSP1、GSP2、GSP3、GSP4，利用试剂盒提供的锚定上游引物进行巢氏PCR法扩增和克隆，并对所克隆的序列进行测定。本专利技术公开的日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白的基因序列如表1所示。日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白基因阅读框架编码1932个核甘酸，即643个氨基酸，见表1。比曼氏血吸虫多了三个碱基(序列中以黑体表示的碱基)见表3。其理论推测氨基酸组成在N端比曼氏的缺少46个氨基酸，其余氨基酸同源性为83.7％，见表2。本专利技术所要解决的另一技术问题是公开日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白在大肠杆菌中的表达。本专利技术公开的日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白通过下述步骤实现在大肠杆菌中的表达1、总RNA的提取由日本血吸虫中国大陆株安徽品系尾蚴感染新西兰大白兔，5周后剖杀冲虫，液氮冻备用。取液氮冻存的虫体200mg，用Gibco公司的Trizol试剂抽提其总RNA，按其说明书进行操作。2、引物设计依据，引物合成的方法1)获得完整ORF的引物设计依据根据已报道的曼氏血吸虫抱雌沟蛋白编码全基因序列SmGcp和日本血吸虫抱雌沟蛋白编码保守区基因SjGcpl序列设计两对引物，分别扩增出日本血吸虫抱雌沟蛋白编码全基因序列的5’和3’区段，再根据测序结果设计第三对引物，扩增日本血吸虫抱雌沟蛋白全基因。引物在Bechman公司生产的Bechman oligo 1000引物合成仪上合成。5’区段引物upper5′-TTCAATCATTGCATCATGTACACCATTTAC-3′；lower5′-CGTTCTTTACCAGTTGAATCAGTTTCACAA-3′。3’区段引物upper5′-ATGGGAATTATTACGTCAAAAGTATTCAAGTGAAC-3′；lower5′-TTAGGACTCAATAAGTGTAACCGTTGTTTCAC-3′。编码全长引物upper5′-CGAAGCTTGACATGGAATCAATTCGGAATCACTC-3′；lower5′-CTGCTCGAGTTAGGACTCAATAAGTGTAACCG-3′。2)获得cDNA5’端区段的引物设计依据根据测序结果所得的日本血吸虫抱雌沟基因序列设计一系列下游引物GSP1、GSP2、GSP3、GSP4，引物在Bechman公司生产的Bechman oligo 1000引物合成仪上合成。巢氏PCR引物GSP15′-CTGCTCGAGTTAGGACTCAATAAGTGTAACCG-3′GSP25′-CGTTCTTTACCAGTTGAATCAGTTTCACAA-3′GSP35′-CGAGTTACATTACATGTCAGCATCCAC-3’GSP45′-TATTTCTCGGCGTTTC3、反转录、PCR扩增和基因克隆1)完整ORF的获得以血吸虫总RNA为模板，下游引物为引物作反转录。反转录试剂盒购自Gibco BRL公司操作按其说明书进行。从前步所得cDNA为模板，以合成的上下游引物进行PCR扩增，特异性扩增产物连接入pGEM-T Easy Vector中(pGEM-T Easy Vector购自Sigma公司)，并转化到大肠杆菌TG1中，经蓝白斑筛选和酶切鉴定，获得重组克隆。2)cDNA5’端区段的获得按5’RACE试剂盒说明书介绍的方法操作，以日本血吸虫总RNA为模板，以GSP1为引物引导反转录合成该基因5’端cDNA，用RNA酶去除模板RNA后，转录产物经GLASSMAX柱纯化，用末端转移酶在其3’端加上poly(dC)尾。然后分别以GSP2、GSP3、GSP4为下游引物，以5’RACE试剂盒提供的锚定引物为上游引物进行巢式PCR，将最后一轮PCR的产物按上述方法克隆、鉴定。4、日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白编码基因鉴定本专利技术对所有基因片段的各两个阳性克隆进行序列测定，其中大部分序列为双向测序确定。日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白基因阅读框架编码1932个核甘酸，即643个氨基酸。该蛋白基因于来源于曼氏血吸虫的抱雌沟蛋白基因相比，其ORF在5’端比曼氏血吸虫该基因的ORF缺少138个碱基，同源性为85％，有368个碱基不同，且在第696至733碱基之间日本血吸虫比曼氏血吸虫多了三个碱基(序列中以黑体表示的碱基)见表3。其理论推测氨基酸组成在N端比曼氏的缺少46个氨基酸，其余氨基酸同源性为83.7％，见表2。本专利技术将编码日本血吸虫抱雌沟蛋白的完整阅读框序列克隆入表达载体pET28c(+)中，在大肠杆菌BL21中获得表达，以重组表达产物进行SDS-PAGE，经电转移到NC膜上，用经pET28c(+)裂解液中和的日本血吸虫成虫抗原免疫血清做一抗进行Western印迹检测，结果在约80kD处有一明显的识别条带，说明所克隆编码日本血吸虫抱雌沟蛋白基因的表达产物具有良好的抗原性。见附图说明图1。5、日本血吸虫抱雌沟蛋白的免疫保护性效果证明本专利技术将SjScp的大肠杆菌表达产物用Ni-NTB柱纯化，用纯化产物作免疫原免疫昆明系小鼠，每只鼠20μg纯化蛋白，共免疫三次，按常规免疫程序操作。首免用弗氏完全佐剂，二免、三免用弗氏不完全佐剂。首免四周后二免，二免两周后三免，三免一周后攻击尾蚴，攻击五周后剖杀小鼠，计算减虫率和减卵率。结果见下表rSjgcp(全长)与rSjGCP1免疫小鼠实验减虫率和减卵率比较平均虫荷数(x±s) 减虫率 平均卵荷数 减卵率Worm burden(x±s) Wormreduction P EPG(x±s) Egg reduction Prate(％) rate(％)rSjgcp 24±3 11.3 ＜0.05 8274±2114 33 ＜0.05rSjgcp121.4±722.8 ＜0.05 9214±2757 26 ＜0.05co本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种编码为日本血吸虫抱雌沟蛋白的核甘酸序列，其特征在于它具有如下的ＤＮＡ核甘酸及相应的氨基酸序列： ｇｔｔａｃａｃｔｇｔ ｔａｔａｃｔｇａａｇ ｔａｇｔｔｔａａａｔ ｇａａａｔａｔｇｔａ ａｔａａｔａａａｔｃ ａａｔａａｇｔａａｔ ６０ ｔａｔａｃａｔａａｃ ａｔｔｔａａｔｔａｇ ｔａｔｔａｃｔｇｔｔ ｔｔｔｇｇａｃａａｔ ｃｔａｔａａａａｔｔ ｔｇｇｔａａａａｔａ １２０ ｔｃｔｇａｃａａａｇ ｔｔａｇｔｔａｔｇｃ ｃａａｔｃｃａｇａｔ ｃａａｇｃａｇｇｇｔ ａｔｃａｔｃａｔｔｇ ｔｇｃａｔｔｔｔｇｇ １８０ ｃｇｔｔｔａｔｃｔｇ ａｔｇｇｔｃａａｔｃ ａａｔｔａｔｔｇｃｔ ｔｃａｔｇｃａｃｔｃ ｃａｔｔｃａｃａｔｔ ａｃａａｃｇｃｔｇｔ ２４０ ｇｇｇａａａａａｇｔ ｔａｇａａｔｔｃｇａ ｔｔａｃａａａｔｇｔ ｔｇｔｇｃｇｇｇａｔ ａｔｇａａａａｇａｔ ｔｇｇａａａａｔｔａ ３００ ｔｃａｔａｔａｃａｔ ｔｔｃｇｔｇａｔｔｔ ｃａａｇａａｇｇａｔ ｇａａｔｇｃｇｃｔｃ ｔａｃａａｇｔａｔｃ ｃｃｃａｔａｔｇａａ ３６０ ｔｔｇｔｇｃ ａｔｇ ｇａａ ｔｃａ ａｔｔ ｃｇｇ ａａｔ ｃａｃ ｔｃｃ ｇａｔ ｇｔａ ｔａｔ ｃｃａ ｔｔｃ ｇｃａ ４０８ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｌａ １ ５ １０ ｇａａ ａａａ ａｔｇ ａａａ ａｃａ ｃｔｃ ａａｔ ｇａａ ｃｔｃ ａａｃ ａｃａ ａａｇ ａａｔ ｃｃａ ｇａｔ ａａａ ４５６ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｙｓ １５ ２０ ２５ ３０ ｃｃａ ｔａｃ ａｃａ ａｔｔ ｔｔｔ ｇｃａ ｃｃａ ａｇｔ ａｃｔ ａｇａ ａａｃ ｇｃｃ ｇａｇ ａａａ ｔａｔ ａａａ ５０４ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｌｙｓ ３５ ４０ ４５ ｇａｔ ｔｔｔ ａｃａ ａａｔ ｔｃａ ｇｃａ ｇａａ ｃａｔ ａｔｔ ｇｔｔ ｃｃａ ｇｇｔ ｃｇａ ｔｔｔ ｔａｔ ｔｔａ ５５２ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林矫矫，金亚美，朱建国，冯新港，吴详甫，周元聪，蔡幼民，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所，上海动物生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]