HPLC-ELSD同时测定鲜冬虫夏草中4种甾醇含量的方法及应用技术

本发明专利技术属于中药材中特定成分的定量分析检测方法领域，具体公开了一种利用HPLC‑ELSD同时测定冬虫夏草中4种甾醇成分含量的方法，以及该方法在鉴别冬虫夏草真伪中的应用。方法包括步骤：(1)供试品溶液制备；(2)对照品溶液制备；(3)HPLC‑ELSD测定，最后同时检测到了冬虫夏草中4种甾醇类物质。本发明专利技术所提供的样品处理方法简单、耗时少，且本发明专利技术所提供的分析方法可达到同时对4种甾醇成分进行定量的目的，结果稳定、准确可靠，利用本发明专利技术的检测方法，可以建立出以冬虫夏草中4个甾醇成分含量作为指标的冬虫夏草质量标准，以及该方法可应用于虫草类中药材真伪的鉴别。

【技术实现步骤摘要】
HPLC-ELSD同时测定鲜冬虫夏草中4种甾醇含量的方法及应用
本专利技术属于中药材中特定成分的定量分析检测方法领域，具体涉及一种利用HPLC-ELSD同时测定冬虫夏草中4种甾醇含量的方法，及其该方法在鉴别冬虫夏草真伪品中的应用。
技术介绍
冬虫夏草是麦角菌科真菌Cordycepssinensis(BerK.)Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的复合体。具有补肺益肾、秘精益气等功效，主治久咳虚喘、唠咳咯血、阳痿遗精、腰膝酸软，是我国传统的名贵中药材。现代药理学研究表明，冬虫夏草对人体免疫系统、循环系统、心血管系统等都是有益的。但野生冬虫夏草主产于我国青海、四川、西藏、云南等省的高寒高原草甸，生长环境特殊，野生资源有限。近年来随着人民生活水平的提高和保健养生意识的增强，消费者对冬虫夏草的需求越来越大，造成冬虫夏草市场供不应求。目前市场上冬虫夏草产品品质参差不齐，各种伪品和虚假宣传层出不穷。最为常见的冬虫夏草伪品是其它虫草属真菌或寄生在其它昆虫体上所形成的复合体，如虫草属的亚香棒虫草、垂头虫草、蛹虫草、蝉花等。另外，以冬虫夏草为主要原材料生产的产品也应运而生。例如从新鲜冬虫夏草中分离得到菌种，采用液体发酵培养法来生产的虫草菌丝体因其产量高、价格低，已成为野生冬虫夏草的主要替代产品。但发酵虫草产品不论是在物质基础和药理活性上，与冬虫夏草均有所不同。面对市场上种类繁多的冬虫夏草产品，无论是野生冬虫夏草、冬虫夏草繁育品或者发酵冬虫夏草产品，都没有一个统一的鉴别标准，因此，开发出一种能有效鉴别冬虫夏草真伪的方法对冬虫夏草的质量评价及安全合理地使用具有重要意义。文献《AdvanceddevelopmentinchemicalanalysisofCordyceps》(《JournalofPharmaceutical&BiomedicalAnalysis》,2014,87(1434):271)报道了冬虫夏草含有多种活性成分，包括核苷、多糖、蛋白、多肽、甾醇、脂肪酸和挥发性成分。同时，目前对冬虫夏草真伪品的鉴别除了通过显微、性状、基因鉴别外，一般通过理化性质鉴别，如文献《冬虫夏草核磁特征指纹图谱建立及鉴别研究》(《世界科学技术-中医药现代化》,2014,16(11))、《冬虫夏草及其混淆品HPLC指纹图谱研究及共有成分鉴定》(《中草药》,2017,48(5):991-996)，但目前对冬虫夏草中的特征性成分甾醇类活性物质研究相对较少，仅有几篇文献报道采用高效液相色谱法-紫外检测器(HPLC-UV)或HPLC-UV-MS、GC-MS测定冬虫夏草中麦角甾醇含量，对冬虫夏草中4种甾醇同时进行定量分析鲜见报道。如文献《冬虫夏草化学成分分析》(《菌物学报》,2016,35(4):476-490)中报道采用BSTFA/TMS法对样品进行衍生化，虽使用GC-MS鉴定出了7种甾醇类物质，但样品需要衍生化导致样品处理过程复杂，所用试剂毒性较大，耗时长。文献《高效液相色谱法测定人工虫草中麦角甾醇的含量》(《山西医科大学学报》，2016,37(4):661-662)中报道样品采用饱和KOH溶液和无水乙醇皂化之后，用环己烷提取3次，提取液用分配柱和吸附柱净化和浓缩提取液，最后使用HPLC-UV分离测定麦角甾醇的量，该文献的样品处理过程复杂、耗时，且仅仅是通过HPLC-UV测定了人工虫草中的麦角甾醇的含量；同样，文献《冬虫夏草(Cordycepssinensis)菌丝体固体发酵粉中麦角甾醇的定量分析》(《沈阳师范大学学报》，2005,23(3)：293-296)也是采用类似的方法制备样品，结果也是仅对麦角甾醇进行定量分析，且若测定冬虫夏草中胆甾醇、谷甾醇等甾醇类末端吸收物质，采用HPLC-UV检测存在基线漂移不稳、响应值小、灵敏度低、重复性差等缺点。
技术实现思路
目前未见采用HPLC-ELSD技术对冬虫夏草中4种甾醇物质同时进行测定的报道。因此，本专利技术的目的是提供一种HPLC-ELSD分析方法，同时测定冬虫夏草中4种甾醇类物质的含量。本专利技术提供的样品处理方法简单、耗时少，且提供的HPLC-ELSD分析检测方法所需要的分离时间短，结果稳定性好、方法可靠，可为冬虫夏草质量控制提供参考。一方面，本专利技术提供了一种利用HPLC-ELSD同时测定冬虫夏草中4种甾醇含量的方法，其中，所述的4种甾醇分别为麦角甾醇、胆甾醇、豆甾醇和谷甾醇；所述方法包括以下步骤：(1)供试品溶液制备：取冬虫夏草样品，加入氢氧化钾-乙醇溶液进行回流提取；随后离心，得上清液；之后过滤，得到供试样品溶液；(2)对照品溶液制备：取对照品麦角甾醇、胆甾醇、豆甾醇和谷甾醇，置于容量瓶中混合均匀，加入氢氧化钾-乙醇充分溶解并定容至刻度线，制成混合对照品溶液；(3)HPLC-ELSD检测：检测条件：色谱柱为C18(4.6×250mm，5μm)；流动相A为水，流动相B为甲酸-甲醇溶液；梯度洗脱：0-10min，3％-0％A；10-30min，0％A；30-35min，0％-3％A；将所述步骤(1)和步骤(2)所得的供试样品溶液和对照品溶液分别注入HPLC-ELSD联用仪，进行检测。优选地，本专利技术在步骤(1)所述的供试品溶液的制备方法为：精密称取冬虫夏草样品，按照重量体积比加入1:5-20g/mL的0.5mol/L氢氧化钾-乙醇溶液进行回流提取，提取时间为15-40min；随后离心，得上清液；之后经滤膜过滤，得到供试样品溶液。优选地，所述流动相B为0.005％-0.2％甲酸-甲醇溶液。进一步优选地，本专利技术中所述的流动相B为0.005％甲酸-甲醇溶液。优选地，本专利技术在步骤(2)中所述对照品溶液的制备方法为：精密称取标准品麦角甾醇、胆甾醇、豆甾醇和谷甾醇各20mg，置于100mL容量瓶中混合均匀，加入0.5mol/L氢氧化钾-乙醇充分溶解后制成混合对照品溶液。进一步优选地，本专利技术在步骤(1)中所述供试品溶液的制备方法为：精密称取样品粉末0.5g，按重量体积比加入10mL0.5mol/L氢氧化钾-乙醇溶液，回流30min，离心，得上清液；之后经过滤，得到供试样品溶液。优选地，本专利技术所述的方法，步骤(3)中HPLC-ELSD检测的条件为：色谱柱：WatersXbridgeC18(4.6×250mm，5μm)；流动相A为水，流动相B为0.005％甲酸-甲醇溶液；柱温30℃，流速1.0mL/min，梯度洗脱：0-10min，3％-0％A；10-30min，0％A；30-35min，0％-3％A；Gain：6；漂移管温度：35℃。另一方面，本专利技术所提供的方法可用于鉴别虫草类中药材是否为正品的冬虫夏草。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术首次采用HPLC-ELSD同时测定冬虫夏草中的4种甾醇类物质，且分离检测所需要的时间短，可在18min实现分离，且分离效果好、结果稳定、可靠，可为冬虫夏草的质量控制提供了参考。(2)本专利技术所提供的检测甾醇类物质的方法简单，且首次对4种甾醇进行定量分析。制备样品过程耗时少，所用试剂安全。(3)本专利技术首次通过冬虫夏草中甾醇类物质对虫草类中药材进行了直观的真伪鉴别，可为虫草类中药材的质量控制提供参考。附图说明图1为混合对照品的HPLC-ELSD色本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时测定冬虫夏草中4种甾醇含量的HPLC‑ELSD方法，其特征在于：所述4种甾醇物质分别为麦角甾醇、胆甾醇、豆甾醇和谷甾醇；所述方法包括以下步骤：(1)供试品溶液制备：取冬虫夏草样品，加入氢氧化钾‑乙醇溶液进行回流提取；随后离心，得上清液；之后过滤，得到供试样品溶液；(2)对照品溶液制备：取对照品麦角甾醇、胆甾醇、豆甾醇和谷甾醇，置于容量瓶中混合均匀，加入氢氧化钾‑乙醇充分溶解并定容至刻度线，制成混合对照品溶液；(3)HPLC‑ELSD检测：检测条件：色谱柱为C18(4.6×250mm,5μm)；流动相A为水，流动相B为甲酸‑甲醇溶液；梯度洗脱：0‑10min，3％‑0％A；10‑30min，0％A；30‑35min，0％‑3％A；将所述步骤(1)和步骤(2)所得的供试样品溶液和对照品溶液分别注入HPLC‑ELSD联用仪，进行检测。

【技术特征摘要】
1.一种同时测定冬虫夏草中4种甾醇含量的HPLC-ELSD方法，其特征在于：所述4种甾醇物质分别为麦角甾醇、胆甾醇、豆甾醇和谷甾醇；所述方法包括以下步骤：(1)供试品溶液制备：取冬虫夏草样品，加入氢氧化钾-乙醇溶液进行回流提取；随后离心，得上清液；之后过滤，得到供试样品溶液；(2)对照品溶液制备：取对照品麦角甾醇、胆甾醇、豆甾醇和谷甾醇，置于容量瓶中混合均匀，加入氢氧化钾-乙醇充分溶解并定容至刻度线，制成混合对照品溶液；(3)HPLC-ELSD检测：检测条件：色谱柱为C18(4.6×250mm,5μm)；流动相A为水，流动相B为甲酸-甲醇溶液；梯度洗脱：0-10min，3％-0％A；10-30min，0％A；30-35min，0％-3％A；将所述步骤(1)和步骤(2)所得的供试样品溶液和对照品溶液分别注入HPLC-ELSD联用仪，进行检测。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中供试品溶液的制备方法为：精密称取冬虫夏草样品，按照重量体积比加入1:5～20g/mL的0.5mol/L氢氧化钾-乙醇溶液进行回流...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文佳，孙敏甜，李文庆，钱正明，邱健健，
申请(专利权)人：广东东阳光药业有限公司，宜昌山城水都冬虫夏草有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44