一种高比活内切木聚糖酶NPWXynB及其基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，具体地，本发明专利技术涉及一种高比活突变内切木聚糖酶NPWXynB及其基因和应用。通过定向进化及定点突变技术对来源于瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的内切木聚糖酶XynB进行分子改造得到高比活木聚糖酶NPWXynB。其氨基酸序列中的第58位用F替代Y，第78位用Y替代M，第94位用S替代Y，第143位用L替代V，第145位用R替代E，第182位用R替代D。本发明专利技术提供的内切木聚糖酶突变体NPWXynB在37℃条件下的比活为11500U/mg，比原始内切木聚糖酶XynB的比活提高82.5％。本发明专利技术构建的含NPWXynB基因的重组工程菌最大酶活可达153000U/mL，极大的降低了生产成本。

【技术实现步骤摘要】
一种高比活内切木聚糖酶NPWXynB及其基因和应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体地，本专利技术涉及一种高比活突变内切木聚糖酶NPWXynB及其基因和应用。
技术介绍
木聚糖作为一种五碳糖，是半纤维素的重要组成部分，广泛的存在于自然界。木聚糖几乎占地球上可更新有机碳含量的三分之一，是仅次于纤维素的第二丰富的多聚糖。木聚糖在裸子植物中占干物质重量的7％-12％，在被子植物中占干物质重量的15％-30％，同时木聚糖也广泛存在于饲料原料中如小麦、玉米等。木聚糖作为一种非淀粉多糖具有很强的抗营养作用，主要表现为：单胃动物难以消化吸收木聚糖；木聚糖可结合大量的水，增加动物消化道内食糜的体积和粘度从而阻碍营养物质的消化和吸收，降低了饲料的利用率。木聚糖酶是指能够将木聚糖降解为低聚木糖和木糖这一类酶的总称，主要包括内切β-1,4木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶等，其中内切β-1,4木聚糖酶在这一类酶中发挥主要作用。来源于瘤胃真菌Neocallimastixpatriciarum的内切木聚糖酶XynB由于其良好的酶学特性，使其在饲料、造纸等行业具有很大的应用潜力。为了使瘤胃真菌Neocallimastixpatriciarum内切木聚糖酶XynB广泛应用到众多工业领域中，提高其比活力及表达水平，降低生产成本是急需解决的问题。本专利技术通过结合定向进化和定点突变技术，提高了瘤胃真菌Neocallimastixpatriciarum内切木聚糖酶XynB的比活力，大大降低了其生产成本，为其进一步工业化应用奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过对来源于瘤胃真菌Neocallimastixpatriciarum的内切木聚糖酶XynB进行分子改造，使改造后的内切木聚糖酶具有更高的比活，降低生产成本，符合工业化大生产的要求。本专利技术的目的是提供一种高比活的突变内切木聚糖酶NPWXynB及其基因。本专利技术的再一目的是提供包含上述的高比活突变内切木聚糖酶基因的重组载体。本专利技术的再一目的是提供包含上述的高比活突变内切木聚糖酶基因的重组菌株。本专利技术的再一目的是提供一种表达突变高比活内切木聚糖酶NPWXynB的方法。Neocallimastixpatriciarum内切木聚糖酶XynB的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示：本专利技术采用易错PCR及定点饱和突变的方法对SEQIDNO.1所示的内切木聚糖酶XynB进行分子改造，经过高通量筛选得到高比活内切木聚糖酶NPWXynB，本专利技术的高比活内切木聚糖酶NPWXynB和原有的Neocallimastixpatriciarum内切木聚糖酶XynB相比，有5个氨基酸的差异，突变位点由+78M,+94Y,+143V,+145E,+182D,突变成+78Y,+94S,+143L,+145R,+182R,突变后的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示：本专利技术还提供了上述高比活内切木聚糖酶NPWXynB的基因序列，其碱基序列如SEQIDNO.3所示：本专利技术还提供了包含上述高比活内切木聚糖酶的重组载体，将本专利技术的高比活木聚糖酶基因NPWXynB连接到酵母表达载体pPICzαA和pPIC9K。上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPICzαA-NPWXynB和pPIC9K-NPWXynB。本专利技术还提供了包含上述高比活内切木聚糖酶基因NPWXynB的重组菌株，优选重组菌株是毕赤酵母菌株X33和GS115。本专利技术还提供了表达上述高比活内切木聚糖酶NPWXynB的方法，包括以下步骤：1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)重组菌株进行发酵，诱导重组木聚糖酶的表达；3)发酵结束后，回收并纯化所表达的木聚糖酶NPWXynB。具体地，将重组表达质粒pPICzαA-NPWXynB和pPIC9K-NPWXynB线性化后，转化到毕赤酵母X33和GS115中，用高浓度的抗生素平板筛选转化子，将筛选到的转化子，首先在摇瓶培养条件下进行比较分析。将摇瓶培养筛选出来的的高酶活转化子，再在50L的发酵罐中进行发酵，发酵过程中，每隔24h取发酵液测定OD600以及菌体湿重，取上清液进行木聚糖酶活性检测。发酵结束最终平均发酵酶活达到153000U/mL，比出发菌的酶活提高56.1％，实现了重组内切木聚糖酶NPWXynB的高效表达。将重组内切木聚糖酶NPWXynB进行分离重化，测定其在37℃的比活为11500U/mg，相比重组木聚糖酶XynB的比活(6300U/mg)，突变后的重组木聚糖酶NPWXynB比活提高了82.5％。本专利技术通过定点突变技术和高通量筛选技术对瘤胃真菌Neocallimastixpatriciarum内切木聚糖酶XynB进行分子改造。突变后的内切木聚糖酶NPWXynB的比活比XynB提高82.5％。含有突变基因NPWXynB的重组工程菌在50L发酵罐培养条件下的平均发酵酶活为153000U/mL。因此，本专利技术的突变内切木聚糖酶NPWXynB及重组工程菌，大大降低了发酵生产成本，使其在众多工业领域中显示出巨大的应用潜力。附图说明图1为内切木聚糖酶XynB和NPWXynB的比活比较图。图2为pPICzαA-NPWXynB酵母菌株在50升发酵罐中的发酵情况。图3为pPIC9K-NPWXynB酵母菌株在50升发酵罐中的发酵情况。图4为内切木聚糖酶XynB和NPWXynB在不同pH值环境下的相对酶活曲线图。图5为内切木聚糖酶XynB和NPWXynB在不同温度下的相对酶活曲线图。具体实施方式以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实验材料和试剂：1、菌株与载体大肠杆菌菌株Topl0、毕赤酵母X33、载体pPICzαA，pGAPzαA,Zeocin购自Invitrogen公司。2、酶与试剂盒PCR酶，质粒提取，胶纯化，限制性内切酶、试剂盒购自上海生工公司。3、培养基大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0)。LBZ为LB培养基加25ug/mLZeocin。酵母培养基为YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)。酵母筛选培养基为YPDZ(YPD+100mg/Lzeocin)。酵母诱导培养基BMGY(I％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V))和BMMY(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同)。重组酵母发酵培养基本盐培养基：磷酸氢二铵5％、磷酸二氢钾0.5％、七水硫酸镁1.5％、硫酸钾1.95％、硫酸钙0.1％、氢氧化钾0.1％、消泡剂0.03％。高压后每升加4.35毫升PTM1。PTM1(微量盐溶液)：硫酸铜0.6％、碘化钾0.018％、一水硫酸锰0.3％、二水钼酸钠0.02％、硼酸0.002％、六水氯化钴0.05％、氯化锌2％、七水硫酸铁6.5％、浓硫酸0.5％、生物素0.02％。实施例1、瘤胃真菌Neocallimastixpatriciarum内切木聚糖酶XynB基因合成及克隆将本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高比活内切木聚糖酶NPWXynB，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
2016.08.09 CN 20161064828821.一种高比活内切木聚糖酶NPWXynB，其特征在于，其氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。2.一种高比活内切木聚糖酶基因NPWXynB，其特征在于，编码权利要求1所述的内切木聚糖酶。3.如权利要求2所述的高比活内切木聚糖酶基因NPWXynB，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。4.一种提高内切木聚糖酶XynB比活的方法，其特征在于，所述方法在包括步骤：定点突变氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的内切木聚糖酶XynB的氨基酸位点：第58位用F替代Y，第78位用Y替代M，第94位用S替代...

【专利技术属性】
技术研发人员：李阳源，王建荣，周银华，夏雨，杨玲，
申请(专利权)人：广东溢多利生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44