一种高效提取干燥植物DNA的方法技术

本发明专利技术涉及一种高效提取干燥植物DNA的方法，运用改良的CTAB法与全式金植物基因组DNA提取试剂盒相结合的方法，能够有效去除多酚和糖类物质对DNA提取的干扰，尤其适应于临近干燥或枯萎的植物干燥叶片，能够有效地富集DNA，并消除颜色对DNA的影响。PCR实验结果证明本发明专利技术提取方法获得的DNA能够达到下游实验的要求。

Method for efficiently extracting dried plant DNA

The invention relates to a method for efficient extraction of dried plant DNA, using the method of modified CTAB method and the type of gold plant genomic DNA Extraction Kit combined, can effectively remove the interference of polyphenols and sugars in DNA extraction, especially suitable for plants in near dry or dry leaves withered, effectively enriched DNA, and eliminate the influence of color on DNA. PCR experimental results show that the DNA obtained by the extraction method can meet the requirements of downstream experiments.

【技术实现步骤摘要】
一种高效提取干燥植物DNA的方法
本专利技术涉及一种植物基因组DNA的提取方法，具体涉及一种高效提取干燥植物DNA的方法。技术背景从植物组织中提取DNA是进行分子生物学方面研究的第一步。高质量的基因组DNA是进行如SSR、ISSR分子标记的基础(张立荣,2002)。迄今为止，人们提出了诸多提取DNA的方法，目前最常用的提取方法是SDS法、CTAB法(MurryMG,1980)。远距离采样一般无法对材料即刻提取DNA，通常采用硅胶脱水干燥保存。有部分研究表明，硅胶脱水干燥的样品中DNA有不同程度的降解，其提取质量远不如鲜样中提取效果(陈亮,2002；王经源,2002)。尤其枯萎的植物样品中DNA易被核酸内源酶降解，硅胶干燥后DNA降解程度更加严重，提取质量下降。因此，亟待开发一种能够适用于临近枯萎植物干燥样品的基因组DNA的通用方法以适应研究要求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高效提取干燥植物样品DNA的方法，该方法通用、高效、安全和简便。实现本专利技术目的的技术方案如下：一种高效提取干燥植物DNA的方法，包括如下步骤：取干燥植物材料，粉碎，加入CTAB裂解缓冲液和一定体积的RnaseA，涡旋振荡；于65℃水浴30-50min，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，颠倒混匀，离心，取上清，加入异丙醇沉淀DNA，离心，弃上清，用EB溶解沉淀，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，颠倒混匀，离心，取上清；加入等体积的BB1，颠倒混匀，将混合液转移至干净离心柱，离心；弃液体，加入适量的CB1，静置一定时间，离心；弃液体，加入适量的WB1，离心；弃液体，再加入适量的WB1，离心；弃液体，离心，彻底去除残留的WB1；用预热至60℃-70℃的EB洗涤离心柱；离心，收集所得离心液，即得植物基因组DNA。本专利技术所述干燥植物材料包括叶片、根、茎等，优选为叶片。本专利技术所述干燥植物材料的含水率低于5％。优选地，本专利技术所述干燥植物(材料)包括山莨菪(Anisodustanguticus)、桃儿七(Sinopodophyllumhexandrum(Royle)Ying)、四数獐牙菜(SwertiatetrapteraMaxim.)、椭圆叶花锚(Haleniaelliptica)。优选地，将粉碎后的植物材料置于无菌离心管总，再加入CTAB裂解缓冲液进行裂解。本专利技术所述CTAB裂解缓冲液与本领域常规配方相同；具体如下：CTAB20g/L，Nacl1.4mol/L，EDTA10mmol/L，Tris100mmol/L，调节pH至8.0。优选地，所述干燥植物材料与CTAB裂解缓冲液的质量体积比为30-50mg/1mL；进一步优选为30mg/1mL。本专利技术在水浴反应过程中，每隔5-8min上下颠倒混合反应液。本专利技术在采用异丙醇沉淀DNA时，是用预冷至-20℃的异丙醇；优选地，所述异丙醇的用量为混合液离心后上清液总体积的2/3。本专利技术所述离心转速为10000-12000rpm，温度为4-15℃，离心时间为1-10min。具体地，所述高效提取干燥植物DNA的方法，包括如下步骤：(1)取粉碎的干燥植物材料30-50mg，加入已预热至65℃的CTAB裂解缓冲液1mL，再加入15ulRnaseA，于65℃水浴30min，每隔5min上下颠倒混匀；(2)加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，轻颠倒混匀，15℃，12000rpm，离心10min；(3)转移上清至干净的离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，轻颠倒混匀，15℃，12000rpm，离心10min；(4)转移上清至干净的离心管中，加入上清液2/3体积的预冷至-20℃的异丙醇，轻颠倒混匀，于-20℃静置30min；(5)于15℃，12000rpm，离心10min，弃上清，加入400ulEB溶解沉淀，加入等体积氯仿-异戊醇(24:1)，轻颠倒混匀，15℃，12000rpm，离心10min；(6)转移上清至干净的离心管中，加入等体积BB1，轻颠倒混匀，将混合液转移至干净离心柱，15℃，12000rpm，离心5min；(7)弃液体，加入500ulCB1，静置5min，15℃，12000rpm，离心5min；(8)弃液体，加入500ulWB1，15℃，12000rpm，离心5min；重复本步骤至少一次；(9)弃液体，15℃，12000rpm，离心5min，彻底去除残留的WB1；(10)弃离心管，将离心柱放置在干净滤纸上风干5min；(11)将离心柱转移到干净的离心管，向离心柱中心膜上加入40ul预热至60℃-70℃的EB，静置2min，15℃，12000rpm，离心2min；重复本步骤至少一次；(12)弃离心柱，收集所得离心液，即得植物基因组DNA。本专利技术所述EB、BB1，CB1、WB1、RnaseA均来自于北京全式金生物技术有限公司提供的DNA提取试剂盒(EasyPurePlantGenomicDNAKit，目录号:EE111)。根据该试剂盒说明书的记载，EB、BB1，CB1、WB1分别为ElutionBuffer，BindingBuffer1，CleanBuffer1，WashBuffer1。与现有技术相对，本专利技术具有以下优点：(1)利用本专利技术方法从干燥植物样品组织中获得的DNA量显著高于普通提取方法获得的DNA，且DNA纯度符合下游应用的要求。(2)经PCR和酶切试验证明最终获得的DNA能够达到一般分子生物学研究的要求。(3)本专利技术提取方法具有通用、高效和简便的特点。附图说明图1为本专利技术实施例1-4中提取的4种干燥植物叶片总DNA的电泳结果，图1中从左到右依次为：DNAmaker(DL2000)；1：山莨菪；2：桃儿七；3：四数獐牙菜；4：椭圆叶花锚。图2为本专利技术实施例1-4中提取的4种干燥植物DNAPCR电泳结果，图2中从左到右依次为：DNAmaker(DL2000)；1：山莨菪；2：桃儿七；3：四数獐牙菜；4：椭圆叶花锚。图3为本专利技术实施例1-4中提取的4种干燥植物DNAEcoRⅠ限制性酶切电泳结果，图3中从左到右依次为:DNAmaker(Trans2KplusII)；1：山莨菪；2：桃儿七；3：四数獐牙菜；4：椭圆叶花锚。图4为本专利技术实验例3-4中提取的4种干燥植物叶片总DNA的电泳效果。图4中从左到右依次为：DNAmaker(Trans2KplusII)；1：山莨菪(CTAB法)；2：桃儿七(CTAB法)；3：四数獐牙菜(CTAB法)；4：椭圆叶花锚(CTAB法)；5：山莨菪(EE111)；6：桃儿七(EE111)；7：四数獐牙菜(EE111)；8：椭圆叶花锚(EE111)。具体实施方式下面结合实施例，对本专利技术的具体实施方式做进一步详细描述，但并不局限于本专利技术，仅作示例说明。下列实施例中未注明具体实验的条件方法，通常按照常规条件，或者制造厂商所建议的条件。本专利技术采用的氯仿、异戊醇和异丙醇优购于北京宏业图成科技有限公司。本专利技术所述EB、BB1，CB1、WB1、RnaseA、RB1、BB1均来自于北京全式金生物技术有限公司提供的DNA提取试剂盒(EasyPurePlantGenomicDNAKit，目录号:EE111)。本专利技术中采用的缩略词语为：CTAB为溴化十六烷基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效提取干燥植物DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：取干燥植物材料，粉碎，加入CTAB裂解缓冲液和一定体积的RnaseA，涡旋振荡；于65℃水浴30‑50min，加入等体积的氯仿‑异戊醇(24:1)，颠倒混匀，离心，取上清，加入异丙醇沉淀DNA，离心，弃上清，用EB溶解沉淀，加入等体积的氯仿‑异戊醇(24:1)，颠倒混匀，离心，取上清；加入等体积的BB1，颠倒混匀，将混合液转移至干净离心柱，离心；弃液体，加入适量的CB1，静置一定时间，离心；弃液体，加入适量的WB1，离心；弃液体，再加入适量的WB1，离心；弃液体，离心，彻底去除残留的WB1；用预热至60℃‑70℃的EB洗涤离心柱；离心，收集所得离心液，即得植物基因组DNA。

【技术特征摘要】
1.一种高效提取干燥植物DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：取干燥植物材料，粉碎，加入CTAB裂解缓冲液和一定体积的RnaseA，涡旋振荡；于65℃水浴30-50min，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，颠倒混匀，离心，取上清，加入异丙醇沉淀DNA，离心，弃上清，用EB溶解沉淀，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，颠倒混匀，离心，取上清；加入等体积的BB1，颠倒混匀，将混合液转移至干净离心柱，离心；弃液体，加入适量的CB1，静置一定时间，离心；弃液体，加入适量的WB1，离心；弃液体，再加入适量的WB1，离心；弃液体，离心，彻底去除残留的WB1；用预热至60℃-70℃的EB洗涤离心柱；离心，收集所得离心液，即得植物基因组DNA。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干燥植物材料包括叶片、根、茎。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述干燥植物材料的含水率低于5％。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述干燥植物包括山莨菪、桃儿七、四数獐牙菜、椭圆叶花锚。5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述干燥植物材料与CTAB裂解缓冲液的质量体积比为30-50mg/1mL；进一步优选为30mg/1mL。6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在水浴反应过程中，每隔5-8min上下颠倒混合反应液。7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，采用预冷至-20℃的异丙醇沉淀DNA；优选地，所述异丙醇的用量为混合液离心后上清液总体积的2/3。8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述离心转速为10000-12000rpm，温度为4-15℃，离心时间为1-10...

【专利技术属性】
技术研发人员：任梦云，关潇，李俊生，陈彦君，
申请(专利权)人：中国环境科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11