美洲大蠊及其提取物的1H-NMR指纹图谱的构建方法技术

本发明专利技术公开了美洲大蠊及其提取物的1H‑NMR指纹图谱的构建方法。本发明专利技术采用核磁共振技术获得美洲大蠊药材及其提取物中的15个化合物，包括3个核苷类成分和12个氨基酸类成分。与传统的HPLC等色谱方法比较，本发明专利技术能够提供更加全面的信息，单次测量就能同时分析核苷和氨基酸类成分。本发明专利技术创新性运用基于1H‑NMR的代谢组学技术，首次同时检测美洲大蠊及其提取物的整体化学成分，最终建立的1H‑NMR指纹图谱可全面控制美洲大蠊及其提取物的质量，为今后美洲大蠊的品种鉴定及其提取物的质量控制提供科学依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种中药材的质量控制方法，特别涉及美洲大蠊及提取物的1H-NMR指纹图谱的构建方法。
技术介绍
美洲大蠊(Periplaneta americana)最早记载于《神农本草经》，列为中品，具有活血通脉、利水消肿、敛疮生肌的功效，主要用于治疗症瘕积聚、小儿疽积和疮痈肿毒等症。目前已报道的文献中，美洲大蠊及其提取物的质量控制主要以一个或多个核苷、氨基酸类成分为指标进行含量测定研究。这种“以点代面”方式无疑不符合中药多成分、多靶点的整体性作用特征。美洲大蠊药材及其提取物的质量评价和控制方法应该立足于分析其整体的化学成分组，而非仅仅分析其中一个或多个成分。而采用1H-NMR代谢组学技术，系统开展美洲大蠊及其提取物的质量控制研究至今尚无报道。
技术实现思路
通过研究，创新性运用基于1H-NMR的代谢组学技术，充分利用其体现整体性、样品制备简单、分析时间快速等方法学优势，最终建立美洲大蠊及其提取物的1H-NMR指纹图谱，可作为测定美洲大蠊药材及提取物中化学组分的方法，也可作为鉴定美洲大蠊药材及其提取物质量控制方法。为今后美洲大蠊的品种鉴定及其提取物的质量控制提供科学依据。本专利技术对美洲大蠊药材及其提取物的核磁共振图谱进行研究，提供了一种快速、简便的美洲大蠊及其提取物的1H-NMR指纹图谱构建方法，与传统HPLC等色谱方法比较，本专利技术能够提供更加全面的信息，单次测量就能同时分析核苷和氨基酸类成分。为美洲大蠊药材及其提取物全面质量检测奠定基础。本专利技术提供的一种美洲大蠊药材的1H-NMR指纹图谱的构建方法，该方法包括以下步骤：称取干燥的美洲大蠊药材粉末0.1～1.0g，置于锥形瓶中，分别加入含3-(三甲基硅基)氘代丙酸钠(TSP)内标物的CD3OD和D2O溶解，得到美洲大蠊药材粉末的浓度为0.1～0.4g/mL，密封，超声提取0.5～2h后，过0.45μm微孔滤膜，取0.6mL滤液至标准的5mm核磁管中，加封，直接用于1H-NMR测定；将核磁管置于核磁共振仪中，采用标准的预饱和脉冲序列压制水峰测定美洲大蠊药材样品1H-NMR指纹图谱，其中测试参数及条件为：采用标准的预饱和脉冲序列(zgpr)压制水峰信号，频率内锁为氘代甲醇，测定温度25℃，观察频率400.13MHz，谱宽6393.9Hz，采样时间4.089s，脉冲延迟时间4s，扫描次数128，脉冲宽度8.97μs，采集数据点65536；其中，CD3OD和D2O溶液的体积比为1:1；KH2PO4的含量为12.32mg/mL。美洲大蠊药材的1H-NMR指纹图谱上质子信号峰分布在δ0-8.4之间，根据质子信号峰的化学位移值和偶合裂分情况，结合参考相关文献获得各对照品的1H-NMR波谱数据，共鉴定出3个核苷类化合物(编号1-3)和12个氨基酸化合物(编号4-15)，见表1。表1美洲大蠊药材中化学成分的1H-NMR归属量取美洲大蠊提取物0.5～3.0mL，置于蒸发皿中，挥干，分别加入含3-(三甲基硅基)氘代丙酸钠(TSP)的内标物的CD3OD和D2O溶解，密封，超声溶解后，过0.45μm微孔滤膜，取0.6mL滤液至标准的5mm核磁管中，加封，直接用于1H-NMR测定；其中，CD3OD和D2O溶液的体积比为1:1；KH2PO4的含量为12.32mg/mL。将核磁管置于核磁共振仪中，采用标准的预饱和脉冲序列压制水峰测定美洲大蠊提取物样品1H-NMR指纹图谱，其中测试参数及条件为：采用标准的预饱和脉冲序列(zgpr)压制水峰信号，频率内锁为氘代甲醇，测定温度25℃，观察频率400.13MHz，谱宽6393.9Hz，采样时间4.089s，脉冲延迟时间4s，扫描次数128，脉冲宽度8.97μs，采集数据点65536；美洲大蠊药材的1H-NMR指纹图谱上质子信号峰分布在δ0-8.4之间，根据质子信号峰的化学位移值和偶合裂分情况，结合参考相关文献获得各对照品1H-NMR波谱数据，共鉴定出3个核苷类化合物(编号1-3)和12个氨基酸化合物(编号4-15)。见表2。表2美洲大蠊药材提取物的1H-NMR归属本专利技术构建的美洲大蠊药材及其提取物的1H-NMR指纹图谱，能同时表征美洲大蠊药材及其提取物中的15种化学成分，均可以在美洲大蠊药材提取物制成的包含但不限于康复新液、康复新胶囊、康复新片等生产或质量检测中应用。与传统的HPLC等色谱方法比较，本专利技术能够提供更加全面的信息，单次测量就能同时分析核苷和氨基酸类成分。所述方法样品制备简单、分析速度快。在实现美洲大蠊药材及提取物全面质量检测方面具有广阔的应用前景。附图说明图1美洲大蠊药材代表性的1H-NMR图谱。图2美洲大蠊药材1H-NMR图谱的信号归属(A低场区；B中场区；C高场区)：1肌苷；2次黄嘌呤；3尿嘧啶；4谷氨酸；5组氨酸；6色氨酸；7苯丙氨酸；8脯氨酸；9天冬氨酸；10精氨酸；11赖氨酸；12缬氨酸；13甘氨酸；14丙氨酸；15亮氨酸。图3-7五批美洲大蠊药材1H-NMR图谱。图8美洲大蠊药材提取物代表性的1H-NMR图谱。图9美洲大蠊药材提取物1H-NMR图谱的信号归属(A低场区；B中场区；C高场区)：1肌苷；2次黄嘌呤；3尿嘧啶；4谷氨酸；5组氨酸；6色氨酸；7苯丙氨酸；8脯氨酸；9天冬氨酸；10精氨酸；11赖氨酸；12缬氨酸；13甘氨酸；14丙氨酸；15亮氨酸。图10-14五批美洲大蠊药材提取物1H-NMR图谱。具体实施方式实施例1：美洲大蠊药材1H-NMR标准指纹图谱的建立1.1仪器与试药核磁共振波谱仪Bruker AVANCE III 400M；Sartorius BP221S电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；KQ-300B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；W201型恒温水浴锅(上海申顺生物科技有限公司)；氘代甲醇(CD3OD，99.8％)；重水(D2O，99.9％)；3-(三甲基硅基)氘代丙酸钠(TSP)购自Sigma-Aldrich(St.Louis,Mo,USA)；分析级磷酸二氢钾(KH2PO4)购自成都市科龙化工试剂厂。美洲大蠊药材由四川好医生攀西药业有限责任公司提供。1.2美洲大蠊药材供试品溶液的制备称取干燥的美洲大蠊药材粉末0.2g，置于锥形瓶中，分别加入含3-(三甲基硅基)氘代丙酸钠(TSP)内标物的CD3OD和D2O溶解，CD3OD和D2O的体积分别为0.7mL和0.7mL，得到美洲大蠊药材粉末的浓度为0.143g/mL，密封，超声提取0.5h后，过0.45μm微孔滤膜，取0.6mL滤液至标准的5mm核磁管中，加封，直接用于1H-NMR测定。1.31H-NMR指纹图谱的测定将核磁管置于核磁共振仪中，采用标准的预饱和脉冲序列压制水峰测定美洲大蠊提取物样品1H-NMR指纹图谱，其中测试参数及条件为：采用标准的预饱和脉冲序列(zgpr)压制水峰信号，频率内锁为氘代甲醇，测定温度25℃，观察频率400.13MHz，谱宽6393.9Hz，采样时间4.089s，脉冲延迟时间4s，扫描次数128，脉冲宽度8.97μs，采集数据点65536。1.41H-NMR指纹图谱质子信号峰的鉴定1H-NMR指纹图谱经过相位校正、基线校正和化学位移校正后，根据质子信号峰的化学位移值和偶合裂分情况，结合参考本文档来自技高网...

【技术保护点】
美洲大蠊的1H‑NMR指纹图谱的构建方法，该方法包括以下步骤：(A)美洲大蠊药材样品溶液的制备称取干燥的美洲大蠊药材粉末0.1～1.0g，置于锥形瓶中，分别加入含3‑(三甲基硅基)氘代丙酸钠(TSP)内标物的CD3OD和D2O溶解，得到美洲大蠊药材粉末的浓度为0.1～0.4g/mL，密封，超声提取0.5～2h后，过0.45μm微孔滤膜，取0.6mL滤液至标准的5mm核磁管中，加封，直接用于1H‑NMR测定；(B)1H‑NMR指纹图谱的测定将核磁管置于核磁共振仪中，采用标准的预饱和脉冲序列压制水峰测定美洲大蠊药材样品1H‑NMR指纹图谱，其中测试参数及条件为：采用标准的预饱和脉冲序列(zgpr)压制水峰信号，频率内锁为氘代甲醇，测定温度25℃，观察频率400.13MHz，谱宽6393.9Hz，采样时间4.089s，脉冲延迟时间4s，扫描次数128，脉冲宽度8.97μs，采集数据点65536；(C)质子信号峰的定性鉴别美洲大蠊药材的1H‑NMR指纹图谱上质子信号峰分布在δ0‑8.4之间，根据质子信号峰的化学位移值和偶合裂分情况，并结合参考相关文献获得各对照品的1H‑NMR波谱数据，共鉴定出3个核苷类化合物和12个氨基酸化合物。...

【技术特征摘要】
1.美洲大蠊的1H-NMR指纹图谱的构建方法，该方法包括以下步骤：(A)美洲大蠊药材样品溶液的制备称取干燥的美洲大蠊药材粉末0.1～1.0g，置于锥形瓶中，分别加入含3-(三甲基硅基)氘代丙酸钠(TSP)内标物的CD3OD和D2O溶解，得到美洲大蠊药材粉末的浓度为0.1～0.4g/mL，密封，超声提取0.5～2h后，过0.45μm微孔滤膜，取0.6mL滤液至标准的5mm核磁管中，加封，直接用于1H-NMR测定；(B)1H-NMR指纹图谱的测定将核磁管置于核磁共振仪中，采用标准的预饱和脉冲序列压制水峰测定美洲大蠊药材样品1H-NMR指纹图谱，其中测试参数及条件为：采用标准的预饱和脉冲序列(zgpr)压制水峰信号，频率内锁为氘代甲醇，测定温度25℃，观察频率400.13MHz，谱宽6393.9Hz，采样时间4.089s，脉冲延迟时间4s，扫描次数128，脉冲宽度8.97μs，采集数据点65536；(C)质子信号峰的定性鉴别美洲大蠊药材的1H-NMR指纹图谱上质子信号峰分布在δ0-8.4之间，根据质子信号峰的化学位移值和偶合裂分情况，并结合参考相关文献获得各对照品的1H-NMR波谱数据，共鉴定出3个核苷类化合物和12个氨基酸化合物。2.根据权利要求1所述的一种美洲大蠊药材的1H-NMR指纹图谱的构建方法，其特征在于所述步骤(A)中美洲大蠊药材样品溶液的制备方法为：称取干燥的美洲大蠊药材粉末0.2g，置于锥形瓶中，分别加入含3-(三甲基硅基)氘代丙酸钠(TSP)内标物的CD3OD和D2O溶解，CD3OD和D2O的体积分别为0.7mL和0.7mL，得到美洲大蠊药材粉末的浓度为0.143g/mL，密封，超声提取0.5h后，过0.45μm微孔滤膜，取0.6mL滤液至标准的5mm核磁管中，加封，直接用于1H-NMR测定。3.根据权利要求1或2所述的一种美洲大蠊药材的1H-NMR指纹图谱的构建方法，其特征在于：CD3OD和D2O溶液的体积比为1:1。4.根据权利要求1或2所述的一种美洲大蠊药材的1H-NMR指纹图谱的构建方法，其特征在于：CD3OD和D2O溶液中还含有KH2PO4，其含量为12.32mg/mL。5.根据权利要求1所述的一种美洲大蠊药材的1H-NMR指纹图谱构建方法，其特征在于：所述步骤(C)中3个核苷类化合物(编号1-3)和12...

【专利技术属性】
技术研发人员：耿福能，
申请(专利权)人：四川好医生攀西药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：四川;51