一种胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒及其制备方法。本发明专利技术能够在同一条检测试纸条上联合检测胰腺癌临床诊断的CA19‑9、CEA、CA242等三种肿瘤标记物，利用免疫层析技术，将CA19‑9、CEA、CA242的单克隆抗体固定在硝酸纤维素膜上制备成反应膜，同时，用不同发射光的量子点标记三种单克隆抗体，将上述量子点标记的抗体混合后喷在玻璃纤维膜上制备成结合垫，再辅以样品垫、吸水垫，组合成量子点免疫试纸条。本发明专利技术公开的试剂盒是采用双抗体夹心法原理，快速检测人全血或血清、血浆中的三种抗原，规避了以前单独检测方法的很多缺陷，一滴血便可以同时检测三种肿瘤标记物、结果更加直观、且灵敏度和特异性均得到了显著的提高，显示出了其在临床应用中巨大潜力。

A pancreatic cancer dry fluorescent quantum dots combined diagnostic kit

The invention discloses a dry type fluorescent quantum dots combined pancreatic cancer diagnosis kit and preparation method thereof. The invention can be on the same test strip on the clinical diagnosis of pancreatic cancer by combined detection of CA19, CEA, CA242 9 and other three kinds of tumor markers, using immune chromatography technology, the monoclonal antibody CA19 9, CEA, CA242 immobilized on nitrocellulose membrane prepared by reaction membrane, at the same time, mark three monoclonal antibodies with different quantum dots emitting light, the antibody mixed the quantum dots after sprayed on glass fiber membrane was prepared with the pad, supplemented by the sample pad, absorbent pad, combination of quantum dots immunostrip. The kit is disclosed by the principle of the double antibody sandwich method, rapid detection of three antigens in whole blood or serum and plasma, to avoid a lot of defects before the separate detection method, a drop of blood can be the simultaneous detection of three tumor markers, more intuitive, and the sensitivity and specificity were obtained remarkably, showing its great potential in clinical application.

【技术实现步骤摘要】
一种胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒
本专利技术属于体外诊断学领域，涉及一种肿瘤诊断试剂盒，尤其是涉及一种胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒及其制备方法。
技术介绍
胰腺癌是指胰腺外分泌系统发生的癌，大多数胰腺癌起源于导管上皮为导管腺癌，少数为囊腺癌、腺泡细胞癌等，它是一种死亡率极高（～99.9%，确诊后）的肿瘤。由于早期无特异性临床症状，胰腺癌的症状取决于肿瘤所在的位置和大小。临床上约有90%以上的患者确诊时已经属于中晚期，失去了最佳治疗时机，其5年生存率仅为5%。在世界普通癌症中，患胰腺癌的男性居世界第四位，女性居第五位，而且预后效果差。因此，实现对胰腺癌的早期诊断，提高胰腺癌患者的生存率，必然是治疗该疾病的关键。目前，诊断胰腺癌的常用检测指标有CA19-9、CEA、CA242、POA和MUC等几种。在实际诊断胰腺癌时，一般是用CA19-9、CEA、CA242三种具有代表性的指标来综合确诊胰腺癌，多种肿瘤标记物的综合分析在特异性和灵敏度上明显高于单一指标。常规实验室或医疗单位用于检测该三项指标通常仅限于采用单一试剂盒，即一个试剂盒针对一种肿瘤标记物的检测，此种方式存在的缺点是：1、检测步骤繁多，费时费力；2、目前三种标记物分别采用三种单指标试剂盒进行检测，然后再进行综合判断，由于不同生产厂家的试剂盒存在差异，且同一厂家的不同试剂盒由于检测的标记物不同可能会存在控制条件、参数的差异而导致检测结果存在误差，此种误差在综合分析三种标记物的特异性和灵敏度上会产生较大的影响，可能导致判断结果相差甚远。因此，开发一种能够在相对统一的检测条件下同时检测该三种胰腺癌肿瘤标记物的试剂盒，降低了由于人为原因造成的系统检测误差，大大提高了胰腺癌临床检测的特异性和灵敏度。现已商品化的免疫层析试纸条多用胶体金作为标记物，虽然检测结果通过肉眼可见，但是胶体金由于颗粒粒径较大、均一性差、免疫标记物不稳定等导致无法实现准确定量检测、灵敏度低等缺陷。量子点（QDs）是一种半导体纳米晶，其激发光谱宽，呈连续分布，发射光谱窄，单色性好、颜色可调并且具有持久的光化学稳定性，其独特的光学性质使其作为一种新型的荧光探针而得到广泛应用。因此，本专利技术用量子点取代传统的胶体金作为标记物可以弥补胶体金标记的不足，专利技术高灵敏度、多指标同时检测、简便、直观、价格低廉的免疫层析方法，提高胰腺癌阳性检测率。
技术实现思路
本专利技术目的在于应用量子点荧光免疫层析技术研制出一种操作简便、价格低廉和结果准确的临床联合检测胰腺癌的试剂盒，可以同时检测CA19-9、CEA、CA242三种肿瘤标记物，从而大大提高胰腺癌的检测速度和效率，相对于单检试剂盒具有灵敏度高及特异性强等优势。同时，每种肿瘤标记物的荧光颜色不同，在紫外光照射下，结果判断更加直观。本专利技术实现其目的采用如下技术方案：一种胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒，包括试纸条、吸滴管、样本稀释液、样本稀释杯和存贮介质，所述的反应卡自下而上依次由样品垫、量子点标记的结合垫、反应膜和吸水垫连接在一起后固定于背衬上而组成；其中，所述的反应膜上含有由CA19-9单克隆抗体、CEA单克隆抗体、CA242单克隆抗体分别包被而成的3条T线即检测线和1条由羊抗鼠IgG包被而成的C线即质控线。其中，所述的量子点标记的结合垫按照以下方法制备得到：将CA19-9单克隆抗体用Em=530nm的量子点标记、CEA单克隆抗体用Em=610nm的量子点标记、CA242单克隆抗体用Em=652nm的量子点标记，即得三种检测液，将三种检测液用检测稀释液混合后（优选为等比例混合），包被于玻璃纤维膜上，即得。优选的，所述的硝酸纤维素膜上的3条检测线和1条质控线按照以下次序排列而成：从靠近吸水垫一端到靠近量子点结合垫一端依次为羊抗鼠IgG质控线（C）、CA19-9单克隆抗体（T1）、CEA单克隆抗体（T2）、CA242单克隆抗体（T3）检测线。所述反应膜为硝酸纤维素膜。所述检测稀释液的组分为5~8%蔗糖、12~15%海藻糖、1.5~2.0%BSA、0.5~1.0%吐温Tween20、1.5~2.0%S9、0.02～0.05%proclin300的0.01MPBS缓冲溶液。所述样本稀释液的组分为0.5～1.0%吐温Tween-20、0.02～0.05%proclin300的0.01MPBS缓冲溶液。所述的背衬为各种硬质的支持物，只有在紫外照射下无荧光且具有负载和支持的功能都可用于本专利技术。本专利技术所述的量子点可为Ⅱ-Ⅳ族元素组成的化合物，如CdS、CdSe、CdTe、ZnS、ZnSe等，以及它们组成的核壳式量子点（如CdSe@CdS、CdSe@ZnS等）的任意一种，且均为水溶性羧基量子点。本专利技术所述同步定量胰腺癌的量子点免疫层析试纸条的制备方法包括以下步骤：1）量子点标记抗体的制备：A、取不同波长量子点分别用磷酸缓冲液调节pH=6～8，加入EDC和sulfo-NHS（QDs:EDC的摩尔比为1:50～1:200；EDC:sulfo-NHS的摩尔比为1:1～5:1），涡旋振荡均匀，室温活化15～60min；B、分别对应加入胰腺癌标记物的相应抗体（CA19-9单抗、CEA单抗、CA242单抗，且QDs和抗体的摩尔比为1:4～1:10），室温振荡反应1～4h；C、反应结束后用分子截留量30～100KDa的超滤离心管浓缩至30～100ul，然后采用凝胶尺寸排阻法进行纯化，收集有荧光的部分，再用超滤离心管浓缩后保存于PBS缓冲溶液中（含0.05%proclin300），4℃保存备用，即得量子点标记抗体检测液；2）结合垫的处理：在湿度为40～60%的条件下，将1）中的检测液用稀释液稀释50～100倍（检测液等比例混合）后，喷到玻璃纤维膜上，37℃干燥1～2h，4℃保存备用。检测稀释液成分为5~8%蔗糖、12~15%海藻糖、1.5~2.0%BSA、0.5~1.0%吐温Tween20、1.5~2.0%S9、0.02～0.05%proclin300的0.01MPBS缓冲溶液。3）制备包被有检测指标的硝酸纤维素膜（NC膜）：检测指标为CA19-9单抗、CEA单抗、CA242单抗。以NC膜为反应膜，将检测指标和羊抗鼠IgG用包被缓冲液调节浓度至0.1～2.0mg/ml，按照1～2ul/cm的溶液划线液量，在湿度为40～60%的条件下，将检测指标和羊抗鼠IgG喷到反应膜上对应的检测区和质控区进行包被，各个指标间隔为3～6mm，放置20～37℃干燥1～2h，4℃保存备用，所用包被液为0.01MPBS缓冲溶液。4）在干燥环境下，依次在荧光专用背衬上粘贴样品垫、步骤2）所得结合垫、步骤3）制得的反应膜以及吸水垫，得到试纸板，将试纸板切割成试纸条，得量子点荧光免疫层析试纸条。本专利技术试剂盒的使用方法及评测标准：定性或定量检测：取200～500ul样本稀释液与10～40ul待检样本充分混匀后，取50～100ul混合液加入到试纸条的样本垫内，反应3～10min即可读取结果，具体操作如下：1）定性检测或半定量检测：用激发量子点的光源范围在320～450nm的普通激发光源照射反应膜区域，根据双抗体夹心原理，当待测样本中含有胰腺癌的相应抗原时，复合物将同时被T线和C线捕获，激光照射下出现2条及本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒，包括试纸条、吸滴管、样本稀释液、样本稀释杯和存贮介质,其特征在于：所述的反应卡自下而上依次由样品垫、量子点标记的结合垫、反应膜和吸水垫连接在一起后固定于背衬上而组成；其中，所述的反应膜上含有由CA19‑9单克隆抗体、CEA单克隆抗体、CA242单克隆抗体分别包被而成的3条T线即检测线和1条由羊抗鼠IgG包被而成的C线即质控线。

【技术特征摘要】
1.一种胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒，包括试纸条、吸滴管、样本稀释液、样本稀释杯和存贮介质,其特征在于：所述的反应卡自下而上依次由样品垫、量子点标记的结合垫、反应膜和吸水垫连接在一起后固定于背衬上而组成；其中，所述的反应膜上含有由CA19-9单克隆抗体、CEA单克隆抗体、CA242单克隆抗体分别包被而成的3条T线即检测线和1条由羊抗鼠IgG包被而成的C线即质控线。2.根据权利要求1所述胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒，其特征在于：所述反应膜为硝酸纤维素膜。3.根据权利要求1所述胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒，其特征在于：所述的量子点标记的结合垫按照以下方法制备得到：将检测液用检测稀释液将其等比例稀释混匀后，包被于玻璃纤维膜上，即得。4.根据权利要求3所述胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒，其特征在于：所述结合垫上的检测液按照以下方法制备得到：将CA19-9单克隆抗体用Em=530nm的量子点标记、CEA单克隆抗体用Em=610nm的量子点标记、CA242单克隆抗体用Em=652nm的量子点标记，即得检测液。5.根据权利要求3所述胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒，其特征在于：所述检测稀释液的组分为5~8%蔗糖、12~15%海藻糖、1.5~2.0%BSA、0.5~1.0%吐温Tween20、1.5~2.0%S9、0.02～0.05%proclin300的0.01MPBS缓冲溶液。6.根据权利要求1所述胰腺癌干式荧光量子点联检诊断试剂盒，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：周勇，吴秀兰，
申请(专利权)人：重庆高圣生物医药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：重庆,50