核酸制备及分析制造技术

技术编号:15516246 阅读:9 留言:0更新日期:2017-06-04 07:19
本发明专利技术公开了一种制备和分析核酸的方法和体系,其中方法包括(a)使接头连接到单个双链靶核酸分子上使双链靶核酸分子末端相连,其中所述接头包括(i)配对区域和(ii)非配对区域;(b)提供(i)接头引物,其与非配对区域互补链上的引物结合位点互补;以及,(ii)目标特异性引物,其与靶核酸的结合位点互补;(c)在接头引物和目标特异性引物存在的条件下进行扩增反应扩增末端相连的双链靶核酸分子,产生第一个扩增分子。该方法检测核酸变异具有很高的灵敏度,在某些情况下检测限(LOD)约0.01%至0.001%。

【技术实现步骤摘要】
核酸制备及分析
本申请涉及基因突变检测
,具体而言,涉及一种用于制备和分析核酸的方法和体系(systems)。
技术介绍
基于核酸的检测能检测到样品中特定核酸(DNA或RNA)的存在。它已被用于各种临床和诊断。对于传染性疾病,基于核酸的诊断能够从感染的生物体内检测到DNA或RNA。对于非传染性疾病,基于核酸的诊断可用于检测特定基因或与疾病相关基因的表达。临床和诊断的一个主要关注是检测具有重要临床意义的低水平突变和少量等位基因的能力。能够辨别突变在很多方面非常重要,尤其是对从组织样本中和体液如血浆或血清进行癌症早期检测;评估手术或化疗后的疾病残留;疾病分期和预后的分子图谱或个性化治疗;监测治疗结果和癌症缓解/复发。高效检测癌症相关的体细胞突变很大程度上取决于所用的技术和方法。大规模平行DNA测序引领了划时代的核酸检测方法,仅用传统的Sanger方法一小部分时间和成本识别成百上千亿的碱基对。不像传统技术简单报告平均基因型,这些技术能统计很多单独的DNA片段,检测出混合物中轻微的突变。然而,这种深度测序的方法有局限性。虽然在理论上,当深度测序足够数量的分子时,任何大小的DNA亚群都是可以检测的,在样本制备和测序过程中导致的误差使得实际的检测受限。混合物的PCR扩增也由于随机的和非随机的扩增偏向性导致群体偏差(populationskewing),进而导致特定变异的代表性不足或者过多(KanagawaT.BiasandArtifactsinMultitemplatePolymeraseChainReactions(PCR).JBiosciBioeng.2003;96:317-23.)。因此,有必要提供富集少数群体等位基因和基因突变的系统和方法。
技术实现思路
本申请旨在提供一种富集少量等位基因和突变的体系和方法,以解决现有技术中的问题。为了实现上述目的,根据本申请的一个方面,本专利技术提供了一种指数扩增一个或多个双链靶核酸的方法。该方法包括:(a)双链靶核酸和接头末端相连得到双链核酸,其中接头包括(i)配对区域和(ii)非配对区域;(b)提供(i)接头引物,此引物可互补或杂交到非配对区域的引物结合位点和(ii)目标特异性引物,此引物可互补或杂交到靶核酸的结合位点;(c)扩增末端相连的双链核酸,扩增反应体系包括接头引物和目标特异性引物。非配对区域可以是环(ring)结构,5’和/或3’突出(overhang),或形成泡泡形(bubble)结构。在一些实施例中,非配对区域是一个环。在这种情况下,这个环含有尿嘧啶,且需在扩增前由尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)切割环。特异性引物、接头引物或两者都可以在5’端包含一个标签序列。标签序列可用于检测,测序,克隆和/或扩增。在其他实施例中,扩增反应体系还包括第一阻断物,(i)此阻断物与靶核酸中的野生型等位基因相匹配或互补,(ii)能够通过DNA聚合酶延伸。扩增反应体系可以进一步包括具有与野生型等位基因相匹配或互补的第二阻断物。第一或第二阻断物包含一个或多个修饰的核酸或键。例如,第一阻断物或第二阻断物可以在3’端有一个修饰的核酸或键。修饰的核苷酸或键包括PNA,LNA,2’-O-甲基核酸,2’-O-烷基核酸,2’-氟核酸,硫代磷酸酯键以及它们的任意组合。在一些实施例中,第一或第二阻断物不与接头引物或目标特异性引物重叠。在上述方法中,靶核酸可以是细胞游离核酸(cfNA),细胞游离DNA(cfDNA)或循环肿瘤DNA(ctDNA)。靶核酸长度在20bp到20kb之间,如20bp到2kb,20bp到1kb,或20bp到200bp。在一些例子中,靶核酸覆盖编码EGFRT790M,EGFRL858R,BRAFV600E,BRAFV600KBRAFV600D,BRAFV600G,BRAFV600A,或BRAFV600R的区域。上述方法可用于获得一个或多个双链靶核酸的序列。该方法包括根据上述方法获得的第一批扩增分子,对第一批扩增分子进行第二次扩增反应获得第二批扩增产物并测序所获得的产物,此扩增反应包括一对带有条形码(barcode)的引物。上述方法可用于评估患有癌症或怀疑有癌症的个体。此方法包括从该个体中获得生物样本;并根据上述方法检测生物样本中是否存在一个或多个靶核苷酸。生物样本包括血清、血浆、全血、唾液和痰。在一些实施例中,评估方法还包括决定或推荐基于所述一个或多个靶核苷酸存在时的治疗方案。在另一些实施例中,该方法进一步包括在所述一个或多个靶核酸存在时实施所述治疗方案。扩增反应可以是多重扩增反应。另一方面,本专利技术提供扩增靶核酸的试剂盒。试剂盒包括(a)接头,接头包括(i)配对区域和(ii)非配对区域;(b)和非配对区域互补部分互补的接头引物,和(c)与靶核苷酸结合位点互补的目标特异性引物。试剂盒还可以包括(d)第一阻断物,与靶核酸的野生型等位位点相匹配或互补的一段序列和(II)能被DNA聚合酶延伸,或(e)第二阻断物,和野生型等位位点互补相匹配或者互补的一段序列。非配对区域可以是一个环,5’和/或3’突出,或一个泡泡形(bubble)。优选地,非配对区域是一个环,可以包含尿嘧啶。至少引物和阻断物之一包含一个或多个修饰核酸或修饰的键,包括但不限于PNA,LNA,2’-O-甲基核酸,2’-O-烷基核酸,2’-氟核酸,硫代磷酸酯键以及它们的任意组合。在一些实施例中,目标特异性引物或接头引物或两者都可以在5’端包含一段标签序列。标签序列可用于检测,测序,克隆和/或扩增。例如,标签可以包括一段和测序引物完全相同或者几乎完全相同的序列用于测序。测序引物例如IlluminaP5barcode引物,IlluminaP7barcode引物,IonTorrentAbarcode引物和IonTorrentP1barcode引物。在这种情况下,试剂盒也可以包括一个或多个包含标签的引物和已知的测序引物,例如IlluminaP5barcodeprimer,IlluminaP7barcodeprimer,IonTorrentbarcodeprimer和IonTorrentP1barcodeprimer。本专利技术涉及准备和分析核酸的方法和体系。本专利技术所述的方法和体系可用于检测特定核酸并用于分析。本专利技术至少部分基于有效富集DNA并且准确扩增目标区域的方法。一个方面,专利技术提供了新方法将唯一标识码(uniqueidentification,UID)整合到对一个特定目标的特异性扩增。和传统以PCR为基础的方法相比,本专利技术可使测序更准确,更能检测罕见的突变。在检测和扩增大量DNA样本中的极少量DNA时,本专利技术可以通过UID来计算富集的极少量DNA模板(例如ctDNA或者cfDNA)的含量,因此特别有用。本专利技术披露了用于分析的一种或多种核酸制备方法:(a)将目标双链核酸和接头在核酸连接的条件下连接成双链核酸,所述接头包括(i)配对区域和(ii)非配对区域;(b)提供(i)目标特异性引物,其与靶核酸的结合位点互补;和/或,(ii)接头引物,其与非配对区域互补链上的引物结合位点互补;(c)在目标特异性引物和/或接头引物存在的条件下进行扩增反应扩增末端相连的双链靶核酸分子,产生第一个扩增分子。例如,图1所示的扩增gRNA片段的本文档来自技高网
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核酸制备及分析

【技术保护点】
一种用于指数扩增双链靶核酸的方法,其特征在于所述方法包括:(a)使接头连接到单个双链靶核酸分子上使双链靶核酸分子末端相连,其中所述接头包括(i)配对区域和(ii)非配对区域;(b)提供(i)目标特异性引物,其与靶核酸的结合位点互补;和/或,(ii)接头引物,其与非配对区域互补链上的引物结合位点互补;(c)在目标特异性引物和/或接头引物存在的条件下进行扩增反应扩增末端相连的双链靶核酸分子,产生第一个扩增分子。

【技术特征摘要】
1.一种用于指数扩增双链靶核酸的方法,其特征在于所述方法包括:(a)使接头连接到单个双链靶核酸分子上使双链靶核酸分子末端相连,其中所述接头包括(i)配对区域和(ii)非配对区域;(b)提供(i)目标特异性引物,其与靶核酸的结合位点互补;和/或,(ii)接头引物,其与非配对区域互补链上的引物结合位点互补;(c)在目标特异性引物和/或接头引物存在的条件下进行扩增反应扩增末端相连的双链靶核酸分子,产生第一个扩增分子。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,其中非配对区域是一个环结构,其5’和/或3’突出,或形成泡泡形(bubble)结构;优选的,非配对区域是一个环结构;优选的,所述环结构含有尿嘧啶,且所述方法还包括和在扩增步骤前由尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)切除环结构的方法。3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,其中目标特异性引物在5'端具有一个标签序列。4.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法,其特征在于,所述扩增反应体系中包括第一阻断物,所述第一阻断物具有第一序列,(i)该序列与靶核酸的野生型等位基因相匹配或互补,且(ii)该序列能够通过DNA聚合酶延伸;优选的,扩增反应体系还包括第二阻断物,此阻断物含有第二序列,该序列与野生型等位基因的互补序列相匹配或互补;优选的,第一阻断物或第二阻断物包括一个或多个修饰的核酸或键;优选的,第一阻断物或第二阻断物3’端有一个修饰的核酸或键;优选的,所述的修饰核苷酸或键包括PNA,LNA,2’-O-甲基核苷酸,2’-O-烷基核酸,2’-O-氟核酸、硫代磷酸酯键,以及它们的任意组合;优选的,第一阻断物或第二阻断物不与接头引物或目标特异性引物重叠。5.根据权利要求1-4所述的方法,其特征在于,靶核酸是ctDNA;优选的,靶核酸长度在20bp-20kb之间;优选的,靶核酸长度在20bp-2kb之间;优选的,靶核酸长度在20bp-1kb之间;优选的,靶核酸长度在20bp-200bp之间;优选的,靶核酸包括编码EGFRT790M,EGFRL858R,BRAFV600E,B...

【专利技术属性】
技术研发人员:胡光辉丁崴何新军孙德斌黄隽
申请(专利权)人:苏州艾达康医疗科技有限公司
类型:发明
国别省市:江苏,32

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