一种基于分子印迹技术的壳四糖单体分离提取方法技术

本发明专利技术公开了一种基于分子印迹技术的壳四糖单体分离提取方法，该分离提取方法步骤如下：布袋式过滤‑纳滤膜过滤‑壳四糖分子印迹树脂吸附‑壳四糖分子印迹树脂洗脱‑脱除锌离子‑冷冻干燥。本发明专利技术的基于分子印迹技术的壳四糖单体分离提取方法与现有技术相比，具有分离工艺步骤简单、生产成本低、壳四糖单体纯度高、可实现规模化制备等特点。

Separation and extraction method of chitosan four saccharide monomer based on molecular imprinting technique

The invention discloses a molecular imprinting technique of shell monomer four sugar extraction method based on the extraction method comprises the following steps: bag type filter nanofiltration membrane shell four sugar molecular imprinting resin adsorption shell four sugar molecular imprinting resin elution removal of zinc ions freeze drying. The present invention with prior extraction method of molecular imprinting technique based on four single shell sugar compared with the steps of separation has the advantages of simple process, low production cost, shell four sugar monomer with high purity, which can realize large-scale preparation.

【技术实现步骤摘要】
一种基于分子印迹技术的壳四糖单体分离提取方法
本专利技术涉及海洋壳寡糖单体分离纯化研究领域，具体地说是一种基于分子印迹技术的壳四糖单体分离提取方法。
技术介绍
寡糖(oligosaccharides)及糖缀合物是生物体内重要的信息物质，在生命过程的细胞识别、信号传导和受体调节过程中扮演着极其重要的角色。壳寡糖(Chitooligosaccharides,COS)是由海洋甲壳质经脱乙酰化、降解以后得到的产物，一般是由3-10个氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成。壳寡糖分子量低能溶于水，且具有优于壳聚糖的生物活性，在保健品、生物化工材料以及食品等领域被广泛利用。目前海洋壳寡糖单体的分离制备存在如下问题：(1)纯度低。由于壳寡糖分离纯化工艺复杂，采用分步沉降法和膜分离法等常规分离方法，难以得到高纯度的壳寡糖单体。因此，目前市售的海洋壳寡糖产品大部分都是低聚合度的壳寡糖混合物，制约了壳寡糖的高值化开发利用。(2)产量小。目前所采用的凝胶色谱法、离子交换色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、醋酸纤维膜电泳法、高效液相色谱法和高效毛细管电泳、快速制备液相色谱仪和灌注层析等仪器分离方法只能制备少量的壳寡糖单体(通常在mg级水平)，难以实现壳寡糖单体的规模化分离制备。(3)价格贵。目前市场上高纯度海洋壳寡糖单体(聚合度n=4~6)是以mg级包装，价格昂贵。例如高纯度的壳四糖至壳六糖单体，销售价格1500~1600元/10mg左右。因此，高纯度的不同聚合度壳寡糖单体的规模化制备，成为制约其应用开发的技术瓶颈。寻找新的分离方法和技术，并实现其规模化制备是壳寡糖开发利用的难点问题之一。综上所述，由于壳寡糖单体(n=4~6)之间物理化学性质和化学结构的差异性非常小，常规的分离提取技术在其提取领域进行规模化推广使用受到制约，因此，壳寡糖单体规模化分离提取困难，成为制约其应用开发的技术瓶颈。寻找新的分离方法和技术，并实现其规模化制备是壳寡糖单体开发利用的难点问题之一。分子印迹聚合物（MIP）是一种基于分子印迹技术(MIT)的新的分离材料，主要用于复杂和预处理手续繁杂的生物或环境样品的分离、提纯和浓缩样。MIP制备方便，是一种价格低廉的高效分离材料，易于实现具有克级(甚至千克级)的制备规模，成为对复杂体系分离提取新兴的研究方向[1,2]。随着MIT的不断发展，近年来国内外科研工作者成功地将该技术用于海洋天然产物的分离提纯。例如，国家海洋局第一海洋研究所的王小如课题组将MIT用于海洋微生物生物碱活性成分的分离提取，取得了很好的分离效果[3]。日本学者TakuyaKubo等人[4]将MIT用于海洋贝类毒素软骨藻酸的色谱分离，从有毒贝类中提取贝类毒素软骨藻酸。为探索糖的分离和测定新方法，国内外学者又将MIT拓展到糖化学研究领域。例如，ZhiliangCheng[5]、YiqunYang[6]和Manju[7]等将MIT与电化学分析、荧光分析等技术相结合，用于单糖的分离和测定；美国的Parmpi[8]等利用MIT制备了MIP水凝胶，用于葡萄糖等单糖的分离和识别；法国的Sineriz[9]研究团队，以葡萄糖-6-O-硫酸盐为模板，研究了MIT在葡萄糖-6-O-硫酸盐识别的应用；土耳其的Okutucu[10]等利用MIT合成了以非共价键识别模式的半乳糖MIP，用于葡萄糖、甘露糖、果糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖和棉子糖等三糖以下糖的选择性识别，在糖的识别研究方面取得了很好的成果。MIT在糖化学领域的这些成功应用，为海洋壳寡糖单体的分离提供了重要的理论依据和技术支撑。综观国内外研究现状，模板分子大部分是三糖(例如棉子糖)以下的单糖和双糖，三糖以上寡糖的分离和识别的研究鲜见报道，而MIT在海洋壳寡糖的分离研究尚未见报。
技术实现思路
本专利技术的技术任务是提供一种生产成本低、制备的壳四糖单体产品纯度高的基于分子印迹技术的壳四糖单体分离提取方法。本专利技术的技术任务是按以下方式实现的，该分离提取方法步骤如下：1）布袋式过滤：将壳聚糖酶解液用布袋式过滤机进行过滤，并静置澄清20min，除去壳聚糖酶解液中的颗粒杂质和不溶物；2）纳滤膜过滤：将布袋式过滤机过滤后的液体用纳滤膜G5进行过滤，获得平均分子量小于1000DA的壳寡糖混合组分透过液；3）壳四糖分子印迹树脂吸附：将壳寡糖混合组分透过液流过装有壳四糖分子印迹树脂的树脂柱，利用壳四糖分子印迹树脂选择性吸附透过液中的壳四糖，实现壳四糖单体与其它壳寡糖组分的分离；4）壳四糖分子印迹树脂洗脱：壳四糖分子印迹树脂吸附饱和后，用洗脱剂进行洗脱；5）脱除锌离子：将洗脱液用活性炭G-60处理后过滤，使得壳四糖和锌离子分离，壳四糖被活性炭吸附；收集活性炭，然后用乙醇与去离子水的混合液将壳四糖洗脱下来，并用盐酸溶液调节溶液pH值至2-4；6）冷冻干燥：收集壳四糖洗脱液，经真空浓缩冻干后，得到壳四糖单体产品。所述的步骤2）中壳四糖分子印迹树脂的合成方法如下：壳四糖分子印迹树脂中各原料的重量配比为：主单体65-95份；配位单体5-15份；致孔剂5-9份；分散剂0.5-1.5份；引发剂0.05-0.3份；将配位单体和引发剂按重量份配比溶于无水乙醇中，使得配位单体和引发剂在无水乙醇中的质量百分比浓度为10-20%，然后将混合液与主单体，致孔剂混合均匀；在强力搅拌下，将此混合体系缓慢加到含有分散剂的三口烧瓶中，通入氮除氧30min；用恒温水浴加热至72-78℃，调控搅拌速度，聚合反应6h，然后升温至80-90℃再继续反应3h；冷至20-30℃后，将聚合物微球过滤、洗涤得到分子印迹树脂微球；将制备的分子印迹树脂微球装入萃取器中，用无水乙醇萃取处理6h，除去致孔剂、引发剂和未反应的少量残留单体，室温凉干后，用洗脱剂溶液搅拌浸泡处理，洗脱掉印迹模板分子和锌离子，再用去离子水洗至pH值至6-8，然后用0.01mol/L的锌离子溶液配位平衡后，并在50-70℃真空干燥，制得壳四糖分子印迹树脂微球。所述的配位单体为N-[2-(二甲氨基)乙基]-N'-[(2-羟基-4-乙烯基苯基)]草酰胺双核锌-壳四糖，主单体为乙二醇二甲基丙烯酸酯，致孔剂为石油醚90-120，引发剂为偶氮二异丁腈，分散剂为聚乙烯醇。所述的洗脱剂为0.1mol/L的盐酸溶液。所述的乙醇和去离子水的混合液中乙醇与去离子水的质量比为1:1。本专利技术的一种基于分子印迹技术的壳四糖单体分离提取方法和现有技术相比，具有以下特点：1）采用壳四糖分子印迹树脂吸附工艺，高选择性从壳聚糖酶解液中分离提取壳四糖单体的方法，与其它水溶性壳寡糖提取技术（专利申请号201310660738；201310019782；201310270184）相比，实现了目标分离物壳四糖单体与其它壳寡糖组分的分离，所制备的壳四糖单体产品纯度高。2）采用壳四糖分子印迹树脂吸附工艺，从壳聚糖酶解液中分离提取壳四糖单体的方法，与其它壳寡糖单体分离技术（专利申请号201110068951；201210146042）制备水平相比，可实现千克级的规模化制备。3）采用壳四糖分子印迹树脂吸附工艺，从壳聚糖酶解液中分离提取壳四糖单体的方法，分离提取工艺不仅简单，而且制备产量大，壳四糖单体产品生产成本低，市场竞争力强。附图说明附图1为壳聚糖酶解产物的H本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于分子印迹技术的壳四糖单体分离提取方法，其特征在于，该分离提取方法步骤如下：1）布袋式过滤：将壳聚糖酶解液用布袋式过滤机进行过滤，并静置澄清20min，除去壳聚糖酶解液中的颗粒杂质和不溶物；2）纳滤膜过滤：将布袋式过滤机过滤后的液体用纳滤膜G5进行过滤，获得平均分子量小于1000DA的壳寡糖混合组分透过液；3）壳四糖分子印迹树脂吸附：将壳寡糖混合组分透过液流过装有壳四糖分子印迹树脂的树脂柱，利用壳四糖分子印迹树脂选择性吸附透过液中的壳四糖，实现壳四糖单体与其它壳寡糖组分的分离；4）壳四糖分子印迹树脂洗脱：壳四糖分子印迹树脂吸附饱和后，用洗脱剂进行洗脱；5）脱除锌离子：将洗脱液用活性炭G‑60处理后过滤，使得壳四糖和锌离子分离，壳四糖被活性炭吸附；收集活性炭，然后用乙醇与去离子水的混合液将壳四糖洗脱下来，并用盐酸溶液调节溶液pH值至2‑4；6）冷冻干燥：收集壳四糖洗脱液，经真空浓缩冻干后，得到壳四糖单体产品。

【技术特征摘要】
1.一种基于分子印迹技术的壳四糖单体分离提取方法，其特征在于，该分离提取方法步骤如下：1）布袋式过滤：将壳聚糖酶解液用布袋式过滤机进行过滤，并静置澄清20min，除去壳聚糖酶解液中的颗粒杂质和不溶物；2）纳滤膜过滤：将布袋式过滤机过滤后的液体用纳滤膜G5进行过滤，获得平均分子量小于1000DA的壳寡糖混合组分透过液；3）壳四糖分子印迹树脂吸附：将壳寡糖混合组分透过液流过装有壳四糖分子印迹树脂的树脂柱，利用壳四糖分子印迹树脂选择性吸附透过液中的壳四糖，实现壳四糖单体与其它壳寡糖组分的分离；4）壳四糖分子印迹树脂洗脱：壳四糖分子印迹树脂吸附饱和后，用洗脱剂进行洗脱；5）脱除锌离子：将洗脱液用活性炭G-60处理后过滤，使得壳四糖和锌离子分离，壳四糖被活性炭吸附；收集活性炭，然后用乙醇与去离子水的混合液将壳四糖洗脱下来，并用盐酸溶液调节溶液pH值至2-4；6）冷冻干燥：收集壳四糖洗脱液，经真空浓缩冻干后，得到壳四糖单体产品。2.根据权利要求1所述的一种基于分子印迹技术的壳四糖单体分离提取方法，其特征在于，所述的步骤2）中壳四糖分子印迹树脂的合成方法如下：壳四糖分子印迹树脂中各原料的重量配比为：主单体65-95份；配位单体5-15份；致孔剂5-9份；分散剂0.5-1.5份；引发剂0.05-0.3份；将配位单体和引发剂按重量份配比溶于无水乙醇中，使得配位单体和引发剂在无水...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑永军，郑康，
申请(专利权)人：郑永军，郑康，
类型：发明
国别省市：山东,37