一种达托霉素的纯化方法技术

本发明专利技术提供了一种达托霉素的纯化方法。具体而言，该方法首先使发酵液经过澄清，再经过大孔吸附树脂和阴离子交换树脂分离，然后采用纳滤浓缩，除内毒素和脱盐、浓缩、过滤等获得高纯度的达托霉素；其中，所述的大孔吸附树脂和阴离子交换树脂分离的步骤顺序可调换。本发明专利技术提供的提纯方法所获得的产物纯度高、杂质少，且操作简单。

A method for purifying daptomycin

The present invention provides a method for purifying daptomycin. Specifically, this method firstly makes the fermentation liquid after clarification, and then through the macroporous resin and anion exchange resin separation, then by nanofiltration, removal of endotoxin and desalting and concentration and filtration to obtain high purity of daptomycin; which can exchange the macroporous resin and the anion exchange resin separation steps order. The purification method provided by the invention has the advantages of high purity, less impurities and simple operation.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种抗生素的提纯方法，具体的说是一种达托霉素的提纯方法。
技术介绍
达托霉素为一类新型的环脂肽类抗生素，由玫瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus)发酵而得，是目前全球首个成功开发的环脂肽类抗生素。达托霉素结构新颖，杀菌机制独特，能在多个方面破坏细菌细胞膜功能，并杀死革兰氏阳性菌，特性表现为抑制作用迅速、体内与体外杀菌作用所需的浓度低，抗生素作用的有效性时间长。在临床上用于治疗因需氧革兰阳性菌引起的感染。达托霉素对耐抗生素的革兰阳性菌，包括对甲氧西林、万古霉素和利奈唑胺耐药菌仍有效。2003年FDA批准了达托霉素注射剂用于治疗由革兰氏阳性菌所致的复杂皮肤和软组织感染，以及金葡菌引起的菌血症和右侧心内膜炎，其安全性和耐受性好，是一种应用前途广阔的抗生素。美国专利US6696412公开了一种“阴离子树脂-疏水性树脂-阴离子树脂”三步纯化达托霉素的方法；美国专利US8058238和US8604164公开了一种“形成聚集体并从聚集体中获得较纯的达托霉素”的纯化方法；美国专利US8853357公开了一种“澄清料液-阴离子树脂-pH2.5-5.0条件过滤”的纯化方法；美国专利US8697638、US8846610和US8796224公开了“用低脂肪醇和乙酸钙形成钙盐沉淀或结晶的条件和钙盐晶型”提纯达脱霉素的方法。但上述方法存在操作繁琐、控制条件苛刻、使用填料和设备价格昂贵等缺点。需要找到新的提纯方法，以简化操作、降低成本。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种稳定、易操作、低成本的纯化达托霉素的方法。本专利技术提供的纯化方法包括如下步骤：1)将达托霉素发酵液澄清；2)将澄清的发酵液经过大孔吸附树脂层析分离得到洗脱液；3)将上述洗脱液经阴离子交换树脂层析；4)将步骤3)收集的洗脱液经过纳滤膜浓缩得到浓缩液；5)任选地，将上述浓缩液经过超滤膜超滤；6)将上述步骤4)所得浓缩液或步骤5)超滤后获得的透出液沉淀，并收集沉淀；7)将收集到的沉淀溶解后经纳滤脱盐或阳离子树脂脱盐；其中，所述的步骤2)、3)顺序可调换。所述的达托霉素发酵液指的是依照本领域已知的方法发酵制备达托霉素时得到的发酵液，例如，依照CN1013120B所公开的方法来发酵而得到的发酵液。这些发酵液中除了含有达托霉素外，还含有大量的杂质。根据本专利技术提供的纯化方法，可得到纯度大于95％的达托霉素。为方便保存，在经过上述步骤7后得到的流出液经过浓缩、0.22μm膜除菌过滤、灌装、-20℃以下冷冻保存得到达托霉素冷冻块或进行冷冻干燥获得冻干粉末。在本专利技术优选的实施方案中，所述的澄清步骤使用的是陶瓷膜、板框或连续流离心机进行澄清；所述陶瓷膜优选孔径为0.1-0.2μm。所述的纳滤膜可以是截留分子量为300-900Da的纳滤膜。所述的超滤膜可以是截留分子量为8-30KDa的超滤膜。步骤6)中所述的沉淀可以通过加入异丙醇来完成。在本专利技术优选的实施方案中，所述的大孔吸附树脂层析分离可以是单步或多步，其中多步层析分离可以使用相同的树脂，也可以使用不同的树脂；当步骤2)、3)顺序不变时，优选分别使用不同的大孔吸附树脂层析分离；当步骤2)、3)的顺序调换时，优选使用单步分离。当使用单步分离时，可采用上海华震科技公司的色谱3号或日本三菱公司的HP20ss。当使用多步分离时，可以先采用罗门哈斯公司的XAD1600或日本三菱公司的HP20树脂进行一步分离后，再采用上海华震科技公司的色谱3号或日本三菱公司的HP20ss树脂两步分离。XAD1600和HP20树脂价格便宜，颗粒较粗，色谱3号和HP20SS树脂树脂颗粒较细，价格相对比较高，但分离效果好。使用XAD1600或HP20树脂对达托霉素澄清液一步分离后，起到一定的分离纯化作用，同时可以保护HP20SS树脂的使用，延长后者的使用寿命。XAD1600或HP20树脂的填充一般为径高比1:3-1:7，可以除去部分色素和极性较小的杂质。色谱3号或HP20SS树脂采用合适浓度的醇类如甲醇、乙醇或者异丙醇等与水混合，辅以缓冲液控制pH，可以得到纯度94％以上的达托霉素。在本专利技术优选的实施方案中，步骤3)采用的阴离子交换树脂为弱碱性阴离子树脂。具体地，所述的阴离子交换树脂可采用日本三菱公司的FPDA-13或上海华震科技公司HZPD-30。所述的阴离子交换树脂可以采用氯化钠，例如1M的氯化钠进行洗脱，获得高浓度高纯度达托霉素，同时除去步骤2)中引入的有机溶剂，可以得到纯度96％以上的达托霉素。步骤2)和步骤3)中可以使用乙酸盐作为缓冲液，例如乙酸钠。在本专利技术优选的实施方案中，步骤4中纳滤时pH为5.5-7.0；在本专利技术优选的实施方案中，步骤7)中纳滤时pH为2.5-5，优选3.0。步骤7)所述的阳离子树脂可以是上海华震科技公司的阳离子树脂HZ-016。在本专利技术特别优选的实施方案中，所述的纯化方法包括如下步骤：1)将达托霉素发酵液降温至15℃以下，用膜孔径为0.1-0.2μm的陶瓷膜、板框或连续流离心机进行澄清，弃掉菌渣，收集达托霉素澄清液；2)将步骤1)所得达托霉素澄清液经多步或单步大孔吸附树脂层析分离后得到达托霉素洗脱液；3)将步骤2)所得达托霉素洗脱液经弱碱性阴离子交换树脂层析进一步提高纯度，并除去有机溶剂；4)将步骤3)收集的料液调节pH至5.5-7.0，经截留分子量为300-900Da的纳滤膜系统浓缩，除去小分子杂质，得到达托霉素浓缩液；5)任选地，将步骤4)得到的浓缩液经过截留分子量为8-30KDa的超滤膜系统，除去内毒素，收集透出液；6)将步骤4)得到的浓缩液或步骤5)得到的透出液浓缩后，加入异丙醇，进行沉淀，甩滤收集沉淀；7)将步骤6)收集的沉淀溶解后，调节pH为5.0-6.5，经阳离子树脂脱盐；或调节pH为2.5-5，优选3.0，经纳滤脱盐；收集流出液；8)将步骤7)得到的流出液浓缩过滤后灌装，-20℃以下冷冻，得到达托霉素冷冻块或进行冷冻干燥获得冻干粉末；其中，所述的步骤2)、步骤3的顺序可相互调换。本专利技术提供的纯化方法能够得到高纯度达托霉素，且操作简单、成本也低。具体实施方式以下通过实例进一步描述本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术的范围。下述实施实例所用实验材料均为达托霉素发酵液，发酵降温后获得。所述达托霉素发酵液按照CN1013120B公开的方法得到。实施例1将达托霉素发酵液300L降温后，用膜孔径为0.1-0.2μm的陶瓷膜进行澄清，弃掉菌渣，收集澄清液890L。将澄清液890L经50LHP20树脂柱纯化，依次用pH5.5含30mM乙酸钠的33％甲醇洗杂和pH6.5含30mM乙酸钠的50％甲醇洗脱，获得纯度＞92％的达托霉素洗脱收集液90L。收集液90L用纯化水稀释至含甲醇10％，经50LHP20SS树脂柱纯化，依次用pH5.5含30mM乙酸钠的5％甲醇洗杂和pH6.5含30mM乙酸钠的45％甲醇洗脱，获得纯度＞94％的达托霉素洗脱收集液80L。收集液80L经过FPDA-13离子交换树脂柱纯化，除去有机溶剂，用1M氯化钠和30mM乙酸钠洗脱，获得纯度＞96％的达托霉素洗脱收集液70L。收集后的料液调节pH至6.0，经截留分子量为360的纳滤膜系统浓缩，除去小分子杂质，得到达托霉素浓缩液5L；浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种达托霉素的纯化方法，包括如下步骤：1)将达托霉素发酵液澄清；2)将澄清的发酵液经过大孔吸附树脂层析分离得到洗脱液；3)将上述洗脱液经阴离子交换树脂层析；4)将步骤3)收集的洗脱液经过纳滤膜浓缩得到浓缩液；5)任选地，将上述浓缩液经过超滤膜超滤；6)将上述步骤4)所得浓缩液或步骤5)超滤后获得的透出液沉淀，并收集沉淀；7)将收集到的沉淀溶解后经纳滤脱盐或阳离子树脂脱盐；其中，所述的步骤2)、3)顺序可相互调换。

【技术特征摘要】
2015.10.16 CN 20151067418061.一种达托霉素的纯化方法，包括如下步骤：1)将达托霉素发酵液澄清；2)将澄清的发酵液经过大孔吸附树脂层析分离得到洗脱液；3)将上述洗脱液经阴离子交换树脂层析；4)将步骤3)收集的洗脱液经过纳滤膜浓缩得到浓缩液；5)任选地，将上述浓缩液经过超滤膜超滤；6)将上述步骤4)所得浓缩液或步骤5)超滤后获得的透出液沉淀，并收集沉淀；7)将收集到的沉淀溶解后经纳滤脱盐或阳离子树脂脱盐；其中，所述的步骤2)、3)顺序可相互调换。2.根据权利要求1所述的纯化方法，其中所述的澄清步骤使用的是陶瓷膜、板框或连续流离心机进行澄清；优选所述陶瓷膜孔径为0.1-0.2μm。3.根据权利要求1所述的纯化方法，其中所述的纳滤膜是截留分子量为300-900Da的纳滤膜。4.根据权利要求1所述的纯化方法，其中所述的超滤膜可以是截留分子量为8-30KDa的超滤膜。5.根据权利要求1所述的纯化方法，步骤6)中所述的沉淀通过加入异丙醇来完成。6.根据权利要求1所述的纯化方法，其中所述的大孔吸附树脂层析分离是单步或多步。7.根据权利要求1所述的纯化方法，其中所述的大孔吸附树脂选自XAD1600、HP20、色谱3号和HP20ss树脂。8.根据权利要求1所述的纯化方法，其中步骤2)、3)顺序不变，所述的大孔吸附树脂层析分离为多步。9.根据权利要求8所述的纯化方法，其中所述的多步分离先使用XAD1600或HP20树脂进行预处理，再采用色谱3号或HP...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈舟舟，湛滢，王宏伟，彭洁，韩培，沈灵佳，
申请(专利权)人：江苏恒瑞医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32