【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程技术,特别涉及一种转SmMYB75基因提高丹参毛状根中丹酚酸含量的方法。
技术介绍
心脑血管疾病是目前威胁全人类健康与生命的“头号杀手”。据统计,全世界每年大约有1700万人死于心脑血管疾病,约占全球总死亡人数的1/3,我国每年大约有300万人死于心脑血管疾病,因此,积极研究高效、低毒和廉价的治疗心脑血管疾病的临床药物对提高人类健康水平具有十分深远的意义。丹参(Salviamiltiorrhiza),为唇形科(Labiatae)鼠尾草属多年生草本植株,以其干燥的根或块茎入药,被广泛地应用于治疗心脑血管疾病,是一种传统的中草药植株。丹参的生物活性成分主要分为两大类:一类为水溶性的酚酸类化合物,主要包括丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、咖啡酸、迷迭香素、丹参素等;另一类为脂溶性的丹参酮类化合物,主要包括丹参酮I、丹参酮IIA、隐丹参酮、二氢丹参酮等。丹参中的丹酚酸在预防人类疾病方面发挥着重要的作用,其生物学活性主要包括抗氧化、抗凝活性、肾脏功能的调节、肝脏的保护、心血管的保护、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎症等。除此之外,丹酚酸还具有抗缺血再灌注、抗血栓、降血压和抗纤维化的作用。在中国,丹参通常被制作为药剂,如片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂、口服液、喷雾、滴丸等,具有极高的药用和经济价值。然而,在传统的栽培模式下,丹参长期栽培时品质退化严重、活性成分含量降低、生长周期长及易受栽培区域和环境等制约;在化学合成过 ...
【技术保护点】
一种转SmMYB75基因提高丹参毛状根中丹酚酸含量的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)采用基因克隆的方法从丹参中克隆获得SmMYB75基因,所述SmMYB75基因序列如SEQ ID:1所示;(2)根据丹参SmMYB75基因序列,把SmMYB75基因可操作性地构建于原核表达的载体,在大肠杆菌中进行表达;(3)定量PCR测定并分析SmMYB75在丹参的不同组织中的表达量及其对甲基茉莉酸调控的诱导表达量;(4)将SmMYB75基因构建于亚细胞定位的载体,转化根瘤农杆菌,进行烟草叶片的瞬时转化,对SmMYB75进行亚细胞定位分析;(5)把SmMYB75基因可操作性地构建于表达调控序列,形成含SmMYB75基因的植物表达载体;(6)将步骤(5)所得的含SmMYB75基因的植物表达载体转化发根农杆菌,获得用于转化丹参的含SmMYB75基因植物表达载体的发根农杆菌菌株;(7)利用步骤(6)所构建的发根农杆菌菌株遗传转化丹参叶片,获得经PCR检测为阳性的丹参转基因毛状根克隆;(8)定量PCR测定步骤(7)获得的丹参转基因毛状根中的SmMYB75基因及丹酚酸生物合成途径中关键酶基因的相对表达量,并筛 ...
【技术特征摘要】
1.一种转SmMYB75基因提高丹参毛状根中丹酚酸含量的方法,其特征在于,包括
以下步骤:
(1)采用基因克隆的方法从丹参中克隆获得SmMYB75基因,所述SmMYB75基因序
列如SEQID:1所示;
(2)根据丹参SmMYB75基因序列,把SmMYB75基因可操作性地构建于原核表达的
载体,在大肠杆菌中进行表达;
(3)定量PCR测定并分析SmMYB75在丹参的不同组织中的表达量及其对甲基茉莉
酸调控的诱导表达量;
(4)将SmMYB75基因构建于亚细胞定位的载体,转化根瘤农杆菌,进行烟草叶片
的瞬时转化,对SmMYB75进行亚细胞定位分析;
(5)把SmMYB75基因可操作性地构建于表达调控序列,形成含SmMYB75基因的植
物表达载体;
(6)将步骤(5)所得的含SmMYB75基因的植物表达载体转化发根农杆菌,获得用
于转化丹参的含SmMYB75基因植物表达载体的发根农杆菌菌株;
(7)利用步骤(6)所构建的发根农杆菌菌株遗传转化丹参叶片,获得经PCR检测
为阳性的丹参转基因毛状根克隆;
(8)定量PCR测定步骤(7)获得的丹参转基因毛状根中的SmMYB75基因及丹酚
酸生物合成途径中关键酶基因的相对表达量,并筛选出过表达SmMYB75基因的根系中基
因表达量提高的根系;
(9)高效液相色谱法测定步骤(8)中丹参转SmMYB75基因毛状根中丹酚酸的含量,
筛选丹酚酸含量显著提高的转基因丹参毛状根根系。
2.根据权利要求1所述的转SmMYB75基因提高丹参毛状根中丹酚酸含量的方法,其
特征在于,步骤(2)所述的原核表达的载体为pET-30a(+),大肠杆菌为菌株Rosetta(DE3),
原核表达的方法如下:
(1)设计SmMYB75基因原核表达的引物,可操作性的连接原核表达的载体,并转
化大肠杆菌;
(2)将构建成功的重组大肠杆菌Rosetta(DE3)加入IPTG诱导剂诱导表达,进行
\tSDS-PAGE电泳分析。
3.根据权利要求1所述的转SmMYB75基因提高丹参毛状根中丹酚酸含量的方法,其
特征在于,步骤(4)所述的亚细胞定位的载体为pMON53...
【专利技术属性】
技术研发人员:开国银,黄芬芬,朱光明,
申请(专利权)人:上海师范大学,上海华宇药业有限公司,
类型:发明
国别省市:上海;31
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