MRNA的CNS递送及其用途制造技术

本发明专利技术除其它方面以外提供了将信使RNA(mRNA)有效递送至中枢神经系统(CNS)的方法和组合物。具体地讲，本发明专利技术提供了给需要递送的受试者鞘内施用包含包封在脂质体内的编码蛋白的mRNA的组合物的方法和组合物，使得施用所述组合物导致mRNA在脑和/或脊髓中的神经元中的细胞内递送。本发明专利技术对治疗诸如脊髓性肌肉萎缩症的CNS疾病、障碍或病症特别有用。

CNS delivery of MRNA and uses thereof

The invention provides methods and compositions for delivering messenger RNA (mRNA) to the central nervous system (CNS) in addition to other aspects. Specifically, the invention provides methods and compositions for subjects delivery of intrathecal administration of a composition comprising encapsulated in liposome protein encoding mRNA, the application of the composition in mRNA neurons in the brain and / or spinal cord in cellular delivery. The present invention is particularly useful in the treatment of CNS disorders, disorders, or disorders such as spinal muscular atrophy.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请案本专利申请要求2014年7月2日提交的美国临时申请号62/020,161和2013年10月22日提交的美国临时申请号61/894,246的优先权，所述申请的公开内容据此以引用方式并入。序列表本说明书提及序列表(2014年10月22日以名称为“2006685-0690_SL.txt”的.txt文件形式电子递交)。.txt文件在2014年10月22日生成并且大小为19,590字节。序列表的全部内容以引用方式并入本文。
技术介绍
仍然需要用于治疗CNS疾病的有效疗法，诸如由神经元细胞蛋白的缺失、异常表达或调节异常直接或间接造成的那些疾病。在实施用于CNS疾病的有效治疗方案时存在若干障碍，主要是由于CNS组织被不可渗透的血脑屏障(BBB)分离并隔离。例如，脊髓性肌肉萎缩症代表由蛋白缺乏造成的CNS疾病。通常，健康个体具有序列几乎相同的运动神经元存活(SMN)基因(SMN-1和SMN-2)中的每一个的功能性拷贝。被诊断为脊髓性肌肉萎缩症的患者通常不能仅仅依靠全长SMN-2的低水平表达来表达全长SMN-1蛋白，这不足以阻止脑中的运动神经元死亡。最近几年，信使RNA(mRNA)疗法已成为用于治疗多种疾病(具体地讲，与一种或多种蛋白缺乏相关联的那些疾病)的日渐重要的选择。虽然有希望用于非神经元疾病，但本领域的技术人员已被劝止实施此类治疗CNS疾病的方法，因为脂质体不能透过BBB，以及神经元细胞的独特复杂的膜组成对于将mRNA递送至神经元细胞内部赋予了独特的挑战(Svennerhol等人，BiochimicaetBiophysicaActa，1992，1128：1-7；以及Karthigasan等人，JournalofNeurochemistry，1994，62：1203-1213)。
技术实现思路
本专利技术除了其它方面以外提供了将编码治疗性蛋白的mRNA有效递送至神经元和CNS的其它细胞类型的改进的方法和组合物。本专利技术部分基于令人意外的发现：可将加载有mRNA的基于脂质或聚合物的纳米颗粒直接施用至CNS空间(例如，通过鞘内施用)并有效渗透神经元细胞膜，导致mRNA在脑和/或脊髓中的神经元中的细胞内递送。在本专利技术之前，已报道神经元细胞膜的特点在于具有独特复杂的脂质组成，不同于非神经元细胞的那些(Svennerhol等人，BiochimicaetBiophysicaActa，1992，1128：1-7；以及Karthigasan等人，JournalofNeurochemistry，1994，62：1203-1213)。因此，据信神经元细胞膜难以渗透。预期即使那些将核酸有效递送至非神经元细胞的脂质体也不能有效渗透神经元细胞膜。令人意外的是，本文所述的基于脂质或聚合物的纳米颗粒可将mRNA有效递送至神经元中，甚至是位于脑和脊柱中心深处的神经元和那些难以治疗的运动神经元。因此，本专利技术提供了用于mRNA的CNS递送的改进的有效方法并且有希望成为用于治疗多种CNS疾病的有效mRNA疗法。因此，在一个方面，本专利技术提供了将mRNA递送至中枢神经系统(CNS)的方法。在一些实施例中，根据本专利技术的创新性方法包括给需要递送的受试者鞘内施用包含包封在脂质体内的编码蛋白的mRNA的组合物，使得施用该组合物导致mRNA在脑和/或脊髓中的神经元中的细胞内递送；其中脂质体包含阳离子或非阳离子脂质、基于胆固醇的脂质和PEG改性脂质。在一些实施例中，将mRNA递送至位于脑内的神经元。在一些实施例中，将mRNA递送至位于脊髓内的神经元。在一些实施例中，将mRNA递送至运动神经元。在一些实施例中，将mRNA递送至上运动神经元和/或下运动神经元。在一些实施例中，运动神经元位于脊髓的前角和/或背根神经节内。在一些实施例中，合适的脂质体包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种中性脂质、一种或多种基于胆固醇的脂质和一种或多种PEG改性脂质。在一些实施例中，合适的阳离子脂质选自C12-200、MC3、DLinDMA、DLinkC2DMA、cKK-E12、ICE(基于咪唑的)、HGT5000、HGT5001、DODAC、DDAB、DMRIE、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMA和DMDMA、DODAC、DLenDMA、DMRIE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin-K-DMA、DLin-K-XTC2-DMA、HGT4003。在一些具体实施例中，一种或多种阳离子脂质包括C12-200。在一些具体实施例中，阳离子脂质包括DLinK22DMA。在某些实施例中，适用于本专利技术的阳离子脂质具有式I-c1-a的结构：或其药学上可接受的盐，其中：每个R2独立地为氢或C1-3烷基；每个q独立地为2至6；每个R′独立地为氢或C1-3烷基；并且每个RL独立地为C8-12烷基。在某些实施例中，合适的阳离子脂质为cKK-E12：在一些实施例中，合适的非阳离子脂质选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-一甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、磷脂酰基脂质或它们的混合物。在一些实施例中，合适的非阳离子脂质为磷脂酰基脂质。在一些实施例中，合适的磷脂酰基脂质为鞘脂质。在一些具体实施例中，合适的鞘脂质为鞘磷脂。在一些实施例中，适用于本专利技术的一种或多种基于胆固醇的脂质选自胆固醇、PEG化胆固醇和/或DC-Chol(N，N-二甲基-N-乙基酰胺基胆固醇)、1，4-二(3-N-油烯基氨基-丙基)哌嗪。在一些实施例中，适用于本专利技术的一种或多种PEG改性脂质包含长度为至多5kDa的聚乙二醇链，所述聚乙二醇链共价附接到具有C6-C20长度烷基链的脂质。在一些实施例中，合适的PEG改性脂质为衍生化神经酰胺，诸如N-辛酰基-鞘氨醇-1-[琥珀酰基(甲氧基聚乙二醇)-2000]。在一些实施例中，合适的PEG改性或PEG化脂质为PEG化胆本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将信使RNA(mRNA)递送至中枢神经系统(CNS)的方法，包括：给需要递送的受试者鞘内施用包含包封在脂质体内的编码蛋白的mRNA的组合物，使得施用所述组合物导致mRNA在脑和/或脊髓中的神经元中的细胞内递送；其中所述脂质体包含阳离子或非阳离子脂质、基于胆固醇的脂质和PEG改性脂质。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.10.22 US 61/894,246;2014.07.02 US 62/020,1611.一种将信使RNA(mRNA)递送至中枢神经系统(CNS)的方法，包括：
给需要递送的受试者鞘内施用包含包封在脂质体内的编码蛋白的mRNA的组合物，使得
施用所述组合物导致mRNA在脑和/或脊髓中的神经元中的细胞内递送；
其中所述脂质体包含阳离子或非阳离子脂质、基于胆固醇的脂质和PEG改性脂质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述脑和/或脊髓中的所述神经元包括所述脊髓中
的运动神经元。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述脑和/或脊髓中的所述神经元选自少突细胞、
少突胶质细胞、星形胶质细胞、神经胶质细胞以及它们的组合。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述脑和/或脊髓中的所述神经元包括前角细
胞和背根神经节。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂质体包含一种或多种阳离子脂
质、一种或多种中性脂质、一种或多种基于胆固醇的脂质和一种或多种PEG改性脂质。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述一种或多种阳离子脂质选自C12-200、MC3、
DLinDMA、DLinkC2DMA、cKK-E12、ICE(基于咪唑的)、HGT5000、HGT5001、DODAC、DDAB、DMRIE、
DOSPA、DOGS、DODAP、DODMAandDMDMA、DODAC、DLenDMA、DMRIE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、
DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin-K-DMA、DLin-K-XTC2-DMA、HGT4003以及
它们的组合。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述一种或多种阳离子脂质包括C12-200。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述一种或多种阳离子脂质包括DLinkC2DMA。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述阳离子脂质为cKK-E12：
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种非阳离子脂质选自
DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱)、DPPC(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酰胆
碱)、DOPE(1,2-二油烯基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺)、DOPC(1,2-二油烯基-sn-甘油-3-磷脂
酰胆碱)、DPPE(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺)、DMPE(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘
油-3-磷酰乙醇胺)、DOPG(,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰-(1'-rac-甘油))、鞘磷脂、神经酰
胺、脑磷脂、脑苷脂、二酰基甘油、POPC、DOPG、DPPG、POPC、POPE、DSPE、SOPE、鞘磷脂。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述一种或多种非阳离子脂质包括鞘磷脂。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种PEG改性脂质选自
DMG-PEG、C8-PEG、DOGPEG、神经酰胺PEG、DSPE-PEG以及它们的组合。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述一种或多种PEG改性脂质占所述总脂质组成
的约1-10摩尔％。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述一种或多种PEG改性脂质占所述总脂质组成
的约5摩尔％。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种基于胆固醇的脂质
选自胆固醇或PEG化胆固醇。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂质体包括选自以下的组合：
C12-200、鞘磷脂、DOPE、胆固醇和DMGPEG；
C12-200、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；
cKK-E12、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；
cKK-E12、鞘磷脂、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；
HGT5001、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；
HGT4003、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；
DLinKC2DMA、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；
ICE、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；
DODMA、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；或
DODMA、鞘磷脂、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂质体的尺寸在约40-100nm范
围内。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA的长度为或大于约0.5kb、
1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb或5kb。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中由所述mRNA编码的所述蛋白通常在
所述脑和/或脊髓中的所述神经元中发挥作用。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中由所述mRNA编码的所述蛋白通常在
所述脊髓中的所述运动神经元中发挥作用。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中由所述mRNA编码的所述蛋白为运动
神经元存活(SMN)蛋白。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA为密码子优化的。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述密码子优化的mRNA包含SEQIDNO:3、SEQ
IDNO:4、SEQIDNO:10或SEQIDNO:11。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述密码子优化的mRNA包含SEQIDNO:3或SEQ
IDNO:4。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述mRNA包含SEQIDNO:7的5’UTR序列。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述mRNA包含SEQIDNO:8或SEQIDNO:9的3’
UTR序列。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA包括帽结构。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述帽结构选自Cap0、Cap1或Ca...

【专利技术属性】
技术研发人员：F·德罗莎，M·哈特莱因，S·卡夫，
申请(专利权)人：夏尔人类遗传性治疗公司，
类型：发明
国别省市：美国;US