本发明专利技术提供一种用于在单细胞水平上同时检测多种耳聋基因的试剂盒。此外，本发明专利技术还提供可在单细胞水平上同时检测多种耳聋基因位点的方法。采用单细胞全基因组扩增技术，通过MDA(multiple displacement amplification)，从单细胞样本等DNA含量极其微少的样本类型中，有效扩增得到总量在μg级的全基因组DNA。由此所得的DNA经过特异引物的PCR扩增后，在测序仪上对扩增产物进行Sanger测序，可以有效对多个遗传性耳聋基因进行检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种PCR扩增方法。具体而言，本专利技术设及一种可同时扩增多种耳聋 基因、特别是人单细胞全基因组来源的耳聋基因的PCR扩增方法。此外，本专利技术还提供一种 用于在单细胞水平上同时检测多种耳聋基因的试剂盒。
技术介绍
耳聋是临床上常见的疾病，由遗传性因素引起的约占60%左右。2006年第二次残 疾人抽样调查显示，我国残疾人总数8000万，其中听力残疾者2670万，1~7岁听障儿童约 有80万。我国每年2000万新生儿中，严重听力障碍发生率为1%。~3%。。新生儿出生听力 缺陷给家庭及社会带来了严重的经济和精神负担。耳聋不仅表现为听不见外界的声音，还 会影响语言的发育，导致患者无法与外界进行沟通。 迄今为止，耳聋在基因层面上没有有效的治疗方法，最好的办法是通过预防、配戴 助听器和人工耳蜗植入术来进行听力修复。导致耳聋的危险因素包括：遗传因素、病毒感 染、生产损伤、药物使用不当、免疫性疾病、生理性退化。 由于导致语前聋的环境因素的存在，有时无法判断患者是否为遗传性聋，同时耳 蜗结构复杂，耳聋听力表现难W区分，常规的电生理检测或生化检测均不能从病因学上给 出满意的解释。运决定了遗传性耳聋基因检测是目前最为有效的病因学分析方法之一。通 过常见耳聋基因检测，可W及早发现携带耳聋基因的患儿（包括迟发性听力缺陷患儿），为 后期的诊断及治疗提供科学依据，有助于及时采取干预措施预防言语障碍的发生，有效地 降低聋哑发病率。运对于语前聋患者尤为重要，可W尽早利用残余听力佩戴助听器或植入 电子耳蜗，防止患儿变哑，对于语后聋患者，可W部分预测W后发病的风险和发病的年龄阶 段，从而尽早预防，并对患者的婚配、生育提供遗传信息。 阳〇化]目前遗传性耳聋基因检测的常规检测手段包括直接测序。直接测序（direct sequencing,D巧是将聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR)扩增产物纯化、 变性后，在测序仪上进行测序，为寻找突变的金标准。 目前遗传性耳聋基因检测主要包含W下基因： (1)GJB2基因突变引起的耳聋大多表现为语前发病，呈对称性，且导致中重度或极 重度耳聋。但目前有学者认为，GJB2基因引起的耳聋在听力损失程度、始发龄及是否为对 称性方面都存在着一定的多态性。多数GJB2基因相关性耳聋为双耳同时受损，但也有单耳 受损的报道；GJB2基因突变引起的耳聋表现为先天性耳聋，但在某些情况下并不在出生时 出现，可表现为听力损害的迟发性。[000引 似GJB3基因突变可导致显性或隐性遗传性非综合征性耳聋。1998年Xia等首次 克隆了GJB3基因，并在两个常染色体显性非综合征性耳聋家系中发现携带GJB3基因突 变，分别是547G〉A和5380T。GJB3基因与GJB2基因虽然不在同一条染色体上，但都编码 连接蛋白，在内耳离子平衡中发挥作用，按照双等位基因致聋的模式，有可能GJB2基因与 GJB3基因共同导致耳聋患者的发病。 (3)线粒体12SrRNA基因A1555G突变，使毛细胞线粒体损伤导致其产能功能丧 失，是听力损害的细胞学基础。此类耳聋患者的临床表型多样，耳聋程度与应用氨基糖武类 药物时的年龄W及发病年龄相关，年龄越小，发生耳聋的程度越重；mtDNAA1555G突变本身 不足W引起临床症状，氨基糖武类药物和核基因在mtDNAA1555G突变的发病机制上起重要 作用。携带mtDNAA1555G突变的成员年龄越小，越易出现听力下降，而且耳聋的程度越重。 (4)SLC26A4基因定位于常染色体7q31区域，含21个外显子，编码1个由780个 氨基酸残基组成的多次跨膜蛋白Pemlrin，属于离子转运体家族，主要与舰/氯离子转运有 关，在机体离子成分平衡的维持中发挥重要作用。近年来国外的多项研究表明SLC26A4基 因突变与Pen化ed综合征（PDS)(前庭水管扩大或伴内耳崎形神经性聋和甲状腺肿）和大 前庭水管综合征（LVA巧有密切的关系。在众多的突变中，多数突变既见于pemlred综合征， 又见于大前庭水管综合征。因此，同一位点的突变可能导致不同的临床表现。 在基于直接测序的遗传性耳聋基因检测中，为了增加检测的准确度，往往需要检 测多个耳聋基因。 阳01引一般而言，对不同的基因的扩增需要采用不同的PCR反应条件。因此，多个耳聋基 因的扩增需要在多个PCR反应程序中进行，运就存在扩增时间长、扩增成本高的问题。此 夕F，如在同一 PCR反应程序的条件下进行多个基因的扩增，则往往存在其中的一个或多个 基因的扩增产物品质不高的问题。
技术实现思路
鉴于上述现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种适用于同时扩增多 个耳聋基因的PCR扩增方法。 本专利技术人为解决上述问题进行了深入研究，结果发现，通过设置特定的PCR反应 程序条件，可W在同一PCR反应程序中同时高品质地扩增（特别是W人单细胞全基因组作 为模板）多个耳聋基因，从而完成了本专利技术。 阳〇1引旨P，本专利技术包括： 1.一种扩增人单细胞全基因组来源的耳聋基因的方法，该方法包括下述步骤： 步骤A对人单细胞全基因组进行扩增；W及 步骤B 步骤A中得到的扩增产物为模板，通过PCR反应扩增耳聋基因；其中， 所述PCR反应的变性溫度为94°C-96°C，退火溫度为59°C-ere,且使用选自下述 引物对1~4中的至少一对或两对或=对或全部作为扩增引物：引物对1 :核巧酸序列如SEQIDN0:1所示的上游引物及核巧酸序列如SEQID NO:2所示的下游引物； 阳02引引物对2:核巧酸序列如SEQIDNO:3所示的上游引物及核巧酸序列如SEQID NO:4所示的下游引物； 阳02引弓I物对3:核巧酸序列如SEQIDNO:5所示的上游引物及核巧酸序列如SEQID NO:6所示的下游引物；W及 引物对4 :选自下述引物对41~47中的至少一对或两对W上： 阳02引弓I物对41 :核巧酸序列如SEQIDNO:7所示的上游引物及核巧酸序列如SEQID NO :8所示的下游引物； 引物对42 :核巧酸序列如SEQ ID NO :9所示的上游引物及核巧酸序列如SEQ ID NO: 10所示的下游引物； 引物对43 :核巧酸序列如SEQ ID NO : 11所示的上游引物及核巧酸序列如SEQ ID NO: 12所示的下游引物； 阳02引引物对44 :核巧酸序列如SEQ ID NO : 13所示的上游引物及核巧酸序列如SEQ ID NO: 14所示的下游引物； 引物对45:核巧酸序列如SEQIDNO: 15所示的上游引物及核巧酸序列如SEQID NO: 16所示的下游引物； 引物对46:核巧酸序列如SEQIDNO: 17所示的上游引物及核巧酸序列如SEQID NO:18所示的下游引物；W及 阳03U 引物对47 :核巧酸序列如SEQ ID NO : 19所示的上游引物及核巧酸序列如SEQ ID NO :20所示的下游引物。 阳0巧2.根据项1所述的方法，其中，所述PCR反应用于扩增选自下述人耳聋基因中的至 少一种或两种或S种或全部：人GJB2基因、人GJB3基因、人12S rRNA、W及人化C26A4基 因。 阳03引 3.根据项1或2所述的方法，其中，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种扩增人单细胞全基因组来源的耳聋基因的方法，该方法包括下述步骤：步骤A：对人单细胞全基因组进行扩增；以及步骤B：以步骤A中得到的扩增产物为模板，通过PCR反应扩增耳聋基因；其中，所述PCR反应的变性温度为94℃‑96℃，退火温度为59℃‑61℃，且使用选自下述引物对1～4中的至少一对或两对或三对或全部作为扩增引物：引物对1：核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物；引物对2：核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的下游引物；引物对3：核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的下游引物；以及引物对4：选自下述引物对41～47中的至少一对或两对以上：引物对41：核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的下游引物；引物对42：核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示的下游引物；引物对43：核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示的下游引物；引物对44：核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示的下游引物；引物对45：核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示的下游引物；引物对46：核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示的下游引物；以及引物对47：核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示的下游引物。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：柳青，白金蕾，玄兆伶，李大为，梁峻彬，陈重建，
申请(专利权)人：安诺优达基因科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。