用于捕获循环肿瘤细胞的仿生微流体装置制造方法及图纸

本发明专利技术提供了从样品中捕获循环肿瘤细胞(CTC)和循环癌细胞(CSC)的方法，所述方法包括在条件下将样品引入基于流动的多通道装置内，所述基于流动的多通道装置具有细胞捕获表面和流动修饰表面，所述条件允许CTC与设置在细胞捕获表面上的细胞滚动诱导试剂和捕获试剂结合。本发明专利技术还提供了基于流动的多通道装置，以从样品中捕获CTC和CSC。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】政府支持陈述本专利技术在由美国国家科学基金会(NationalScienceFoundation)(NSF)授予的CBET-0931472下由政府支持进行。政府在本专利技术中拥有一定权利。与相关申请的交叉引用本专利申请要求于2014年3月7日提交的美国临时专利申请号61/949,472的优先权，所述美国临时专利申请的公开内容以引用的方式全文并入本文。
本专利技术涉及从样品中捕获循环肿瘤细胞(CTC)和循环癌症干细胞(CSC)的方法，以及用于执行该方法的多通道微流体装置。
技术介绍
癌症仍是世界上最具破坏性的疾病之一，每年具有超过1千万新病例。尽管治疗原发性肿瘤的诊断和治疗方法中的近期进展已导致过去两年癌症死亡率的减少，但癌症转移仍构成极大挑战，因为患者经常复发。散播和循环肿瘤细胞(分别为DTC和CTC)已知诱导在距离原发性肿瘤的遥远部位处的继发性肿瘤形成，称为转移。描述癌症转移的两种主要理论，种子和土壤假说以及机械截留理论，是可用的，并且关于各自的外渗过程是相似的，由三个序贯步骤组成。转移机制已知通过细胞滚动起始-所述细胞滚动是用于将白细胞召募至炎症部位的天然存在的过程。在第二步中，细胞紧密附着至内皮细胞。在第三步中，细胞通过内皮迁移(血细胞渗出)，导致继发性肿瘤形成。关于转移性癌症的诊断和预后的研究努力已集中于骨髓(BM)中的DTC和血液中的CTC的检测。DTC的检测要求BM的抽吸-这是一个侵入性、耗时且通常对于患者疼痛的过程，排除了对于预后研究连同治疗性处理必要的重复取样。因而，癌症患者的外周血中的CTC的有效检测拥有作为替代方案的希望，由于它的最低限度侵入性和容易取样(即抽血)。然而，CTC的临床使用仍未实现用于常规临床实践。事实上，患者血液中的CTC的临床意义不如BM中的DTC明确。与使用基于Ficoll的测定或OncoQuick方法以及其他免疫磁性富集程序相对容易富集的BM中的DTC不同，CTC是非常罕见的(估计在106-109个正常血细胞的背景下一个肿瘤细胞的范围内)，呈现CTC的有效临床显著检测的巨大挑战。肿瘤已知包含肿瘤起始细胞或循环癌症干细胞。循环癌症干细胞能够自我更新且生成分化后代，以与正常干细胞相似的方式组构分层细胞系统。这些细胞显示出在使用免疫缺陷小鼠的异种移植物移植中显著的致瘤活性，其指示了细胞在癌症发展中的重要作用。另外，存在CSC可在治疗后的复发和转移中起关键作用的越来越多的证据(Trumpp和Wiestler，Nat.Clin.Pract.Oncol.5：337-47，2008)。因此，存在有效分离循环肿瘤细胞和循环干细胞的装置和方法的需要，所述装置和方法具有增强的灵敏度和特异性以帮助癌症的诊断和预后。
技术实现思路
本专利技术的仿生平台可容纳在一个平台上的多重通道，所述多重通道可靶向循环肿瘤细胞(CTC)和癌症干细胞(CSC)。第一通道(图1中的区域‘i′)可基于与CTC标记物的特异性结合，从癌症患者血液中捕获CTC，所述CTC标记物例如上皮细胞粘附分子(EpCAM)、人表皮生长因子受体-2(HER-2)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、CD24和叶酸结合受体(FAR)。捕获的CTC可使用胰蛋白酶或其他基于EDTA的脱离溶液从区域‘i’处脱离。在捕获的CTC中，更多的干细胞样CTC，潜在的CSC则可使用对于CSC特异性的其他通道(图1中的区域‘ii’)进行区分。对于细胞区分，干细胞标记物例如CD44、CXCR1、N-钙粘蛋白和CD133可在第二通道上利用。这种CTC和CSC的原位捕获和区分概念可扩展至多重通道系统。关于多重通道系统的例子之一，三通道装置，显示于图1B中。另外，这种三通道流动室可用于其他目的：例如来自不同癌症患者的三个血液样本的同时CTC捕获，以用于CTC和CSC的高流通量筛选和捕获。关于两通道和三通道流动室的示例性尺寸在图2中指示。为了使CTC检测效率达到最大，关于表面官能化的参数，即E-选择素和抗体的宽度以及抗体条的角度可如图3中所示加以改变。本专利技术的装置改善CTC和CSC分离的灵敏度和特异性。首先，细胞滚动诱导试剂例如E-选择素的固定改善CTC和CSC与红血细胞和血浆的分离。重要的是，天然存在的细胞滚动现象是将快速流动细胞召募至捕获表面的最有效方式之一，消除经常导致堵塞和非特异性捕获问题的流动波动的需要。第二，肿瘤细胞特异性和/或干细胞特异性捕获试剂例如抗体通过树状聚合物纳米接头的固定实现强多价结合，以增强捕获效率。第三，本专利技术的装置的模块性质允许使用任何标记物作为捕获试剂，所述捕获试剂理想地适合于具有高度异质表型的CTC和CSC的有效检测。另外，本专利技术的最佳化多通道装置实现以高流通量的CTC以及CSC的高度有效捕获。例如，在关于单通道设计的0.4dyn/cm2或50μL/分钟的相同流速时，三通道设计将实现在7分钟而不是20分钟内1mL血液的分析。本专利技术提供了从样品中捕获CTC和CSC的方法，所述方法包括将所述样品引入基于流动的装置内的步骤，其中所述装置包括至少两个室，第一室包含固定的细胞滚动诱导试剂和固定的CTC特异性捕获试剂，并且第二室包含固定的细胞滚动诱导试剂和固定的CSC特异性捕获试剂，并且在允许CTC和CSC与细胞滚动诱导试剂和捕获试剂结合的条件下，将所述样品引入装置内。样品是包含CTC和/或CSC的任何流体，例如血液、淋巴液或脑脊髓液。在本专利技术的方法中，用于捕获CTC和/或CSC的捕获试剂是与CTC或CSC特异性结合的任何试剂，例如抗体、抗体片段、工程抗体、叶酸、转铁蛋白、肽和适体。在本专利技术的方法的任一种中，CTC特异性捕获试剂特异性结合在CTC表面上的部分，例如抗体、抗体片段、工程抗体、叶酸、转铁蛋白、肽和适体。例如，捕获试剂与例如上皮细胞粘附分子(EpCAM)、人表皮生长因子受体-2(HER-2)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、CD24或叶酸结合受体(FAR)结合。另外，CTC特异性捕获试剂是肽，例如RGD肽。在本专利技术的方法的任一种中，CSC特异性捕获试剂特异性结合在CSC表面上的部分，例如抗体、抗体片段、工程抗体、叶酸、转铁蛋白、肽或适体。例如，CSC特异性捕获试剂与例如CD44、CXCR1、N-钙粘蛋白、CD10、CD127或CD133结合。在本专利技术的方法的任一种中，用于捕获CTC和/或CSC的捕获试剂经由与装置的表面附着而固定，或试剂经由与接头的附着而固定，所述接头附着至装置的表面。在本专利技术的方法中使用的将捕获试剂附着至装置表面的接头是聚合物纳米接头，例如与聚乙二醇共价附着的经修饰的聚(酰胺-胺)树状聚合物。在一个方面，经修饰的聚(酰胺-胺)树状聚合物选自第3代、第4代、第5代、第6代、第7代、第8代和第9代经修饰的聚(酰胺-胺)树状聚合物。在另一个方面，聚合物纳米接头包含与聚乙二醇共价附着的聚酯-n-羧酸酯-1-炔烃树枝状物，其中n是8、16、32、64或128。本专利技术提供了本专利技术的方法中的任一种，所述方法还包括对引入装置内的样品施加.05至10dyn/cm2的剪切应力的步骤。在方法的另一个方面，剪切应力为0.1dyn/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从样品中捕获循环肿瘤细胞(CTC)和循环癌症干细胞(CSC)的方法，所述方法包括将所述样品引入基于流动的装置内的步骤，其中所述装置包括至少两个室，所述第一室包含固定的细胞滚动试剂和固定的CTC特异性捕获试剂，并且所述第二室包含固定的细胞滚动试剂和固定的CSC特异性捕获试剂，并且在允许CTC和CSC与所述细胞滚动试剂和所述捕获试剂结合的条件下，将所述样品引入所述装置内。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.07 US 61/9494721.一种从样品中捕获循环肿瘤细胞(CTC)和循环癌症干细胞(CSC)的方法，所述方法包括将所述样品引入基于流动的装置内的步骤，其中所述装置包括至少两个室，所述第一室包含固定的细胞滚动试剂和固定的CTC特异性捕获试剂，并且所述第二室包含固定的细胞滚动试剂和固定的CSC特异性捕获试剂，并且在允许CTC和CSC与所述细胞滚动试剂和所述捕获试剂结合的条件下，将所述样品引入所述装置内。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述捕获试剂是抗体、抗体片段、工程抗体、叶酸、转铁蛋白、肽和适体。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述对于CTC特异性的捕获试剂特异性结合在CTC表面上的部分。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述捕获试剂与上皮细胞粘附分子(EpCAM)、人表皮生长因子受体-2(HER-2)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、CD24和叶酸结合受体(FAR)结合。5.根据权利要求3所述的方法，其中所述捕获试剂是RGD肽。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述对于CSC特异性的捕获试剂特异性结合在CSC表面上的部分。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述捕获试剂与CD44、CXCR1、N-钙粘蛋白、CD10、CD127和CD133结合。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述捕获试剂经由与所述装置的表面的附着而固定。9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述捕获试剂经由与接头的附着而固定，所述接头与所述装置的表面附着。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述接头是聚合物纳米接头。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述聚合物纳米接头包含与聚乙二醇共价附着的经修饰的聚(酰胺-胺)树状聚合物。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述经修饰的聚(酰胺-胺)树状聚合物选自第3代、第4代、第5代、第6代、第7代、第8代和第9代经修饰的聚(酰胺-胺)树状聚合物。13.根据权利要求11所述的方法，其中所述聚合物纳米接头包含与聚乙二醇共价附着的聚酯-n-羧酸酯-1-炔烃树枝状物，其中n是8、16、32、64或128。14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，所述方法还包括对引入所述装置内的所述样品施加.05至10dyn/cm2的剪切应力。15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述细胞滚动诱导试剂是选择素或选择素的CTC结合片段。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述选择素选自E-选择素、P-选择素和L-选择素。17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述细胞滚动诱导试剂与所述微流体装置的表面共价附着。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述细胞滚动诱导试剂经由选自环氧基、羧基、硫醇基、炔基、叠氮基、马来酰亚胺基、羟基、胺基、醛基及其组合的化学部分与所述表面共价附着。19.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述细胞滚动诱导试剂经由接头固定至所述微流体装置的表面。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述接头选自树状聚合物、树枝状物、右旋糖、聚乙二醇、聚(L-赖氨酸)、聚(L-谷氨酸)、聚乙烯醇、聚乙烯亚胺、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)及其组合。21.一种用于从样品中捕获循环肿瘤细胞(CTC)和循环癌症干细胞(CSC)的微流体装置，所述微流体装置包括：(a)包括细胞捕获表面和流动动员表面的第一通道，其中CTC特异性...

【专利技术属性】
技术研发人员：S洪，JH明，
申请(专利权)人：伊利诺伊大学评议会，
类型：发明
国别省市：美国;US