五个烟草金属硫蛋白基因的新应用制造技术

本发明专利技术公开了五个烟草金属硫蛋白NtMT1，NtMT2，NtMT3，NtMT4和NtMT5及其编码基因在改良植物对重金属镉的耐受性或富集性中的应用。该基因在工程菌酿酒酵母中表达可以提高酵母对镉的耐受能力，同时使酵母中镉的含量提高，表明五个烟草金属硫蛋白具有重金属镉解毒的能力；此外，表达五个烟草金属硫蛋白基因的酵母对氧化胁迫的耐受性提高。若将该基因在工程菌中进行转基因表达，一方面，可以改变工程菌对重金属镉耐受性，另一方面也可以提高转基因工程菌对重金属镉的积累，从而将该工程菌应用于环境污染中重金属镉的微生物修复工程。该基因具有应用于植物抗镉的遗传工程育种的潜力，通过调控该基因在植物中的表达，获取重金属镉超积累的转基因植物，用于重金属污染的植物修复工程。

New application of five tobacco metallothionein genes

The present invention discloses the application of five tobacco metallothionein NtMT1, NtMT2, NtMT3, NtMT4 and NtMT5 and its coding gene in the improvement of plant tolerance to cadmium. The expression of the gene can improve the tolerance to cadmium in yeast Saccharomyces cerevisiae engineering, at the same time, the content of cadmium in yeast increased, showed that the ability of five tobacco metallothionein with cadmium detoxification; in addition, the expression of the five tobacco metallothionein gene in yeast of stress tolerance of oxygen increase. If the gene transgenic expression in engineering bacteria on the one hand, can change the engineering bacteria on cadmium tolerance, on the other hand can also improve genetically engineered bacteria to heavy metal cadmium accumulation, and microbial remediation engineering of the engineering bacteria used in the heavy metal cadmium in environmental pollution. The gene with Genetic Engineering Breeding Application in plant resistance to cadmium potential, by regulating the expression of this gene in plants, transgenic plants for cadmium hyperaccumulator, phytoremediation for heavy metal pollution engineering.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物基因工程领域，具体涉及五个烟草金属硫蛋白(NicotianatabacumMetallothionein,NtMT)及其编码基因和在调控酵母镉耐受和积累方面的应用。
技术介绍
金属硫蛋白是生物体内广泛存在的小分子蛋白，富含半胱氨酸，结构高度保守。研究表明，金属硫蛋白可以结合镉、锌、铜在内的多种重金属离子，在细胞内具有重金属解毒的功能，同时还可以参与微量元素的储存、转运和代谢。同时，由于金属硫蛋白含有多个还原性的半胱氨酸残基，具有较强的抗氧化能力，能清除细胞内富余的活性氧，降低由各种逆境胁迫照成的氧化胁迫伤害。由此可见，金属硫蛋白强大的生化功能决定了该类蛋白具有较大的应用潜力。通过克隆不同生物体内的金属硫蛋白基因，并开发该类基因的应用价值，具有重大的意义。本专利技术公布了烟草中的五个金属硫蛋白基因的克隆，并公开了该类基因在针对重金属镉污染的植物基因工程和微生物基因工程方面的应用价值。来自工业、采矿业和化肥的重金属对环境的污染已成为当今世界重要的环境问题之一。而镉污染在我国所有土壤污染物中排名第一，土壤镉污染超标面积已达我国国土总面积的7％。重金属污染一个重要的特点就是不能被降解，可以长期存在于环境中，并通过食物链进入人体，最终危害人体健康。针对环境的重金属清除技术包括微生物修复和植物修复技术，将金属硫蛋白基因应用于生物工程，用于改造微生物和植物，提高其对重金属的富集能力，具有重要的意义。目前，还没有文献报道烟草体内的金属硫蛋白基因是否能影响重金属(特别是镉)在生物体内，特别是烟草中的的耐受或者积累。在本专利技术中，我们主要公开了烟草体内的五个金属硫蛋白基因，该类基因在烟草体内的表达对重金属镉胁迫响应。金属硫蛋白基因的表达能够影响重金属镉在生物体内的积累，提供了将该类基因应用于工程菌——酿酒酵母的耐镉遗传改造的应用，也可应用于针对镉污染微生物修复工程菌的遗传改造；本专利技术也阐述了可将该基因应用于植物的遗传改造，培育用于重金属镉污染植物修复的转基因重金属超积累植物。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供五个烟草金属硫蛋白NtMT1，NtMT2，NtMT3，NtMT4和NtMT5；及其编码基因NtMT1，NtMT2，NtMT3，NtMT4和NtMT5的新应用。实现上述目的的技术方案如下：NtMT1，NtMT2，NtMT3，NtMT4和NtMT5基因在改良植物对重金属镉的耐受性或富集性中的应用，所述NtMT1，NtMT2，NtMT3，NtMT4和NtMT5基因的cDNA分别为如SEQIDNO.1，SEQIDNO.3，SEQIDNO.5，SEQIDNO.7和SEQIDNO.9所示的核苷酸序列，或分别为与SEQIDNO.1，SEQIDNO.3，SEQIDNO.5，SEQIDNO.7和SEQIDNO.9互补配对的的核苷酸序列，或分别为编码SEQIDNO.2，SEQIDNO.4，SEQIDNO.6，SEQIDNO.8和SEQIDNO.10所示烟草金属硫蛋白的核苷酸序列。氨基酸序列分别如SEQIDNO.2，SEQIDNO.4，SEQIDNO.6，SEQIDNO.8和SEQIDNO.10所示烟草金属硫蛋白NtMT1，NtMT2，NtMT3，NtMT4和NtMT5在改良植物对重金属Cd的耐受性或富集性中的应用。本专利技术的五个烟草金属硫蛋白NtMT1，NtMT2，NtMT3，NtMT4和NtMT5，其氨基酸序列分别如序列表中SEQIDNO.2，SEQIDNO.4，SEQIDNO.6，SEQIDNO.8和SEQIDNO.10所示，其编码基因NtMT1，NtMT2，NtMT3，NtMT4和NtMT5的cDNA核苷酸序列分别如序列表中SEQIDNO.1，SEQIDNO.3，SEQIDNO.5，SEQIDNO.7和SEQIDNO.9所示。应当理解，考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本专利技术的保护范围内。本专利技术将上述五个烟草金属硫蛋白基因应用于植物基因工程中，用于改变转基因植物对重金属镉的耐受和富集的可能性。本专利技术公开了五个烟草金属硫蛋白基因在镉胁迫下的诱导表达特征，表明了该基因参与重金属镉的应答及解毒。本专利技术采用realtimeRT-PCR的方法鉴定了五个烟草金属硫蛋白基因在重金属Cd胁迫下的表达特征，论证了该基因为烟草体内应答重金属胁迫的重要基因，进一步延伸了该基因作为影响烟草重金属积累和胁迫的候选功能基因。本专利技术的另一目的是公开一组酿酒酵母重组表达载体以及相应的酿酒酵母及其应用，该重组载体插入了五个烟草金属硫蛋白基因。将该重组载体转化进入酿酒酵母中，通过半乳糖诱导该基因在酵母中的超表达，能够在镉胁迫下，提高酵母对重金属镉的耐受，并改变酵母细胞内镉积累。具体技术方案如下。插入有上述NtMT1，NtMT2，NtMT3，NtMT4和NtMT5基因的cDNA阅读框序列的酿酒酵母重组表达载体。上述酿酒酵母重组表达载体在改良工程菌株酿酒酵母对重金属镉的耐受性或富集性中的应用。一种酿酒酵母，其转化有上述的酿酒酵母重组表达载体。该酿酒酵母在对环境中重金属镉污染的微生物修复工程中的应用。本专利技术的另一目的是提供一种改良烟草中重金属镉的耐受性或富集性的生物制剂。实现上述目的的技术方案如下。一种改良烟草中重金属镉耐受性或富集性的生物制剂，其活性成份来源于上述酿酒酵母重组表达载体或酿酒酵母，或其活性成份含有NtMT1，NtMT2，NtMT3，NtMT4和/或NtMT5基因，所述NtMT1，NtMT2，NtMT3，NtMT4和NtMT5基因的cDNA分别为如SEQIDNO.1，SEQIDNO.3，SEQIDNO.5，SEQIDNO.7和SEQIDNO.9所示的核苷酸序列，或分别为与SEQIDNO.1，SEQIDNO.3，SEQIDNO.5，SEQIDNO.7和SEQIDNO.9互补配对的核苷酸序列，或分别为编码SEQIDNO.2，SEQIDNO.4，SEQIDNO.6，SEQIDNO.8和SEQIDNO.10所示烟草金属硫蛋白的苷酸序列。本专利技术的另一目的是提供一种调控烟草中重金属镉的耐受性或富集性的方法。一种调控烟草中重金属镉的耐受性或富集性的方法，该方法步骤中包括调控烟草中上述NtMT1、NtMT2、NtMT3、NtMT4、和/或NtMT5基因的表达。本专利技术的有益效果如下：在本专利技术中，我们通过对筛选文库获得的五个烟草金属硫蛋白基因NtMT1，NtMT2，NtMT3，NtMT4和NtMT5的进行应用性探索本文档来自技高网...

【技术保护点】
NtMT1、NtMT2、NtMT3、NtMT4、和/或NtMT5基因在改良植物对重金属镉的耐受性或富集性中的应用，所述NtMT1、NtMT2、NtMT3、NtMT4、NtMT5基因的cDNA分别为如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列，或分别为与SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9互补配对的的核苷酸序列，或分别为编码SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10所示烟草金属硫蛋白的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.NtMT1、NtMT2、NtMT3、NtMT4、和/或NtMT5基因在改良植物对重金属镉的耐
受性或富集性中的应用，所述NtMT1、NtMT2、NtMT3、NtMT4、NtMT5基因的
cDNA分别为如SEQIDNO.1，SEQIDNO.3，SEQIDNO.5、SEQIDNO.7、SEQ
IDNO.9所示的核苷酸序列，或分别为与SEQIDNO.1，SEQIDNO.3，SEQID
NO.5、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9互补配对的的核苷酸序列，或分别为编码SEQ
IDNO.2，SEQIDNO.4，SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10所示烟草
金属硫蛋白的核苷酸序列。
2.氨基酸序列分别如SEQIDNO.2，SEQIDNO.4，SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、
SEQIDNO.10所示烟草金属硫蛋白NtMT1，NtMT2，NtMT3，NtMT4和NtMT5
在改良植物对重金属镉的耐受性或富集性中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征是，所述植物为水稻。
4.插入有权利要求1中所述的NtMT1、NtMT2、NtMT3、NtMT4、NtMT5基因的阅
读框核苷酸序列的酿酒酵母重组表达载体，所述NtMT1、NtMT2、NtMT3、NtMT4、
NtMT5基因的cDNA分别为如SEQIDNO.1，SEQIDNO.3，SEQIDNO.5、SEQ
IDNO.7、SEQIDNO.9所示的核苷酸序列，或分别为与SEQIDNO.1，SEQID
NO.3，SEQIDNO.5、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9互补配对的的核苷酸序列，
或分别为编码SEQIDNO.2，SEQIDNO.4，SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQ
IDNO.10所示烟草金属硫蛋白的核苷酸序列。
5.权利要求4所述的酿酒酵母重组表达载体在改良工程菌株酵母对重金属镉的耐
受性或富集性中的应用...

【专利技术属性】
技术研发人员：张美，莫辉，郭艳，
申请(专利权)人：中国科学院华南植物园，
类型：发明
国别省市：广东;44