一种谷物中伏马毒素的液相色谱串联质谱检测方法技术

本发明专利技术公开一种谷物中伏马毒素的液相色谱串联质谱检测方法，即将谷物样品溶解于甲醇溶液中，离心收集上清液，再注入含有季胺基的固相萃取柱洗脱，收集洗脱液吹干获得残渣，将残渣再次溶解于甲醇溶液中，过滤，滤液为样品提纯液体，对样品提纯液体进行高效液相色谱串联质谱检测，检测结果带入公式1曲线进行比对，即获得样品中伏马毒素的含量；本发明专利技术耗时短，灵敏准确的特点，可适用于大批量样品的检测，解决了传统的伏马毒素采用免疫亲和柱检测成本高或需要衍生化过程复杂的问题，本方法的建立使小麦和玉米等植物中伏马毒素的含量得以准确测定，能为农产品质量安全风险评估提供准确的分析方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及农产质量安全检测
，特别是一种谷物中伏马毒素的液相色谱串联质谱检测方法。
技术介绍
伏马毒素是由串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)、轮枝镰刀菌(Fusariumverticillioides)等在一定温度和湿度条件下产生的，是一类由多氢醇与丙三羧酸组成的双脂类化合物。主要分布在以小麦、玉米等农作物中，可造成秧苗枯萎，根、茎、种子腐烂等农业经济损失。截止目前为止，发现的伏马毒素有FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4、FP1共11种，但其分布主要以FB1、FB2和FB3这3种形式存在，其中FB1是危害范围最大和研究最广的伏马毒素。伏马毒素一类水溶性次级代谢产物，与人或动物机体内神经鞘氨醇结构几位相似，在神经鞘脂代谢过程中能竞争性地结合神经鞘氨醇N-2酰基转移酶，从而抑制神经鞘氨醇的生物合成、阻碍鞘脂类代谢，引发各种疾病。研究证实，伏马毒素能引起马大脑白质软化症、猪肺水肿综合征等，此外伏马毒素还具有很强的细胞毒性及免疫毒性，与人类食道癌的放生密切相关。因此，国际癌症研究中心将伏马毒素列为2B级致癌物作为人类潜在的致癌物质。农产品质量安全检测能力是衡量一个国家农产品质量安全水平的关键指标，在农产品质量安全控制系统中处于优先地位。目前农产品中伏马毒素检测方法主要有、柱前衍生-高效液相色谱法免疫亲和柱、薄层免疫法等，这些方法前处理复杂且灵敏度较低，且检测成本较高，不能满足大量样品的快速衡量检测的要求。目前尚缺乏能同时对不同谷物(小麦或玉米)中快速、灵敏且成本较低的衡量检测伏马毒素分析方法。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供一种伏马毒素的检测方法，即先对样品进行提取净化，净化液经高效液相色谱串联质谱技术(LC/MS/MS)检测，最后通过基质标准曲线定量测定样品中伏马毒素，本专利技术是这样实现的：一种谷物中伏马毒素的液相色谱串联质谱检测方法，具体步骤如下：(1)样品提纯将等体积的甲醇与水混合后，按照体积质量比5:1(mL/g)加入谷物样品粉末中，以180rpm振荡30min后，2500rpm离心5min，收集上清液；取3mL上清液注入含有季胺基的固相萃取柱(CNWBOND SAX SPE Cartridge，500mg，6mL)，流速1d/s(滴/秒)，然后分别取甲醇和水各5mL淋洗固相萃取柱,流速2d/s(滴/秒)；再将甲醇与甲酸按体积比99:1混合后，取10mL加入固相萃取柱以洗脱伏马毒素，流速2d/s(滴/秒)，收集洗脱液以氮气吹干，吹干后的残渣溶解于体积比为50％的甲醇水溶液中，过0.22μm的滤膜，收集滤液，即为样品提纯液体；(2)取伏马毒素标准品并配制成标准储备液，用50％(体积比)乙腈逐级稀释，至少配制成5种不同浓度的标准储备液；对这些不同浓度的标准储备液进行高效液相色谱串联质谱检测，建立0.02μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL的伏马毒素标准曲线；(3)对步骤(1)获得的样品提纯液体进行高效液相色谱串联质谱检测，检测结果带入步骤(2)获得的标准曲线，外标法定量算出样品中各伏马毒素的浓度，再由公式(1)计算获得样品中伏马毒素的含量； X i = A i × c i × V A s i × m - - - ( 1 ) ]]>式(1)中：Xi——样品中各伏马毒素残留含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；Ai——样品中各伏马毒素的峰面积；Asi——伏马毒素标准溶液中各伏马毒素的峰面积；ci——伏马毒素标准溶液中各伏马毒素的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；V——样品中最终定容体积，单位为毫升(mL)；m——最终样品代表的试样量，单位为克(g)。进一步，本专利技术所述谷物中伏马毒素的液相色谱串联质谱检测方法中，所述高效液相色谱串联质谱检测具体是指：(1)色谱条件：a)色谱柱：菲罗门Kinetex100A色谱柱(2.6u C18100×2.3mm)；b)进样量：2μL；c)柱温：40℃；d)流速：0.5mL/min；e)流动相和洗脱时间：流动相A：0.385g/L的酸酸铵溶液；流动相B：甲醇；洗脱时间0-1.6min，初始流动相A从90％到60％，流动相B从10％到40％；洗脱时间1.6-10min，流动相A从60％到40％，流动相B从40％到60％；洗脱时间10-11min，流动相A从40％到90％，流动相B从60％到10％；洗脱时间11-12min，流动相A从90％到40％，流动相B从10％到60％；洗脱时间12-15min，流动相A维持90％，流动相B维持10％。共运行15min；(2)质谱条件：电喷雾电离正离子模式，离子源温度500℃，驻留时间100ms，雾化气压50psi，辅助气压50psi，喷雾电压5500V，碰撞室射出电压6V，通过MRM方式进行定量。进一步，本专利技术所述谷物中伏马毒素的液相色谱串联质谱检测方法中，所述谷物为小麦或玉米。进一步，本专利技术所述谷物中伏马毒素的液相色谱串联质谱检测方法中，其特征在于，所述谷物样品粉末是指过2.00mm孔筛后的谷物样品粉末。本专利技术与其他检测方法相比具有耗时短，灵敏准确的特点，可适用于大批量样品的检测。同时本专利技术解决了传统的伏马毒素采用免疫亲和柱检测成本高或需要衍生化过程复杂的问题。本方法的建立使小麦和玉米等植物中伏马毒素的含量得以准确测定，能为农产品质量安全风险评估提供准确的分析方法。附图说明图1伏马毒素色谱图。图2不同样品中伏马毒素检测色谱图。具体实施方式下面通过实例对本专利技术做进一步的描述，这些描述并不是对本
技术实现思路
进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本
技术实现思路
所做的等同替换或相应的改进，仍属于本专利技术的保护范围之内。实施例中所用的高效液相色谱串联质谱为日本岛津20ADXR液相色谱系统串联美国AB3500质谱系统。实施例1建立标准曲线1、伏马毒素标准储备液的配制：称取FB1、FB2、FB3各10.0ng，分别用乙腈与水的混合液(体积比1:1)溶解并定容到100mL容量瓶中，FB1、FB2、FB3的浓度均为100μg/mL。伏马毒素混合标准储备液：取FB1、FB2、FB3的标准储备液各1mL，定容到10mL得到10μg/mL的FB1、FB2、FB3的混合标准储备液。2、样品提纯将等体积的甲醇与水混合后，按照体积质量比5:1(mL/g)加入谷物样品(分别为小麦和玉米)粉末中，以180rpm振荡30min后，2500rpm离心5min，收集上清液；取3mL上清液注入含有季胺基的固相萃取柱，流速1d/s，然后分别取甲醇和水各5mL淋洗固相萃取柱,流速2d/s；再将甲醇与甲酸按体积比99:1混合后，取10mL加入固相萃取柱，流速2d/s，收集洗脱液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种谷物中伏马毒素的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)样品提纯将等体积的甲醇与水混合后，按照体积质量比5:1加入谷物样品粉末中，以180rpm振荡30min后，2500rpm离心5min，收集上清液；取3mL上清液注入含有季胺基的固相萃取柱，流速1d/s，然后分别取甲醇和水各5mL淋洗固相萃取柱,流速2d/s；再将甲醇与甲酸按体积比99:1混合后，取10mL加入固相萃取柱，流速2d/s，收集洗脱液以氮气吹干，吹干后的残渣溶解于体积比为50％的甲醇水溶液中，过0.22μm的滤膜，收集滤液，即为样品提纯液体；(2)取浓度依次为20，100，500，1000，2000ng/mL的伏马毒素标准溶液，分别进行高效液相色谱串联质谱检测，获得伏马毒素标准曲线；(3)对步骤(1)获得的样品提纯液体进行高效液相色谱串联质谱检测，检测结果带入步骤(2)获得的标准曲线，以外标法测得样品中各伏马毒素的浓度，再通过公式(1)计算获得样品中伏马毒素的含量；Xi=Ai×ci×VAsi×m---(1)]]>式(1)中：Xi——样品中各伏马毒素残留含量，单位为mg/kg；Ai——样品中各伏马毒素的峰面积；Asi——伏马毒素标准溶液中各伏马毒素的峰面积；ci——伏马毒素标准溶液中各伏马毒素的浓度，单位为μg/mL；V——样品最终定容体积，单位为mL；m——最终样品代表的试样量，单位为g。...

【技术特征摘要】
1.一种谷物中伏马毒素的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)样品提纯将等体积的甲醇与水混合后，按照体积质量比5:1加入谷物样品粉末中，以180rpm振荡30min后，2500rpm离心5min，收集上清液；取3mL上清液注入含有季胺基的固相萃取柱，流速1d/s，然后分别取甲醇和水各5mL淋洗固相萃取柱,流速2d/s；再将甲醇与甲酸按体积比99:1混合后，取10mL加入固相萃取柱，流速2d/s，收集洗脱液以氮气吹干，吹干后的残渣溶解于体积比为50％的甲醇水溶液中，过0.22μm的滤膜，收集滤液，即为样品提纯液体；(2)取浓度依次为20，100，500，1000，2000ng/mL的伏马毒素标准溶液，分别进行高效液相色谱串联质谱检测，获得伏马毒素标准曲线；(3)对步骤(1)获得的样品提纯液体进行高效液相色谱串联质谱检测，检测结果带入步骤(2)获得的标准曲线，以外标法测得样品中各伏马毒素的浓度，再通过公式(1)计算获得样品中伏马毒素的含量； X i = A i × c i × V A s i × m - - - ( 1 ) ]]>式(1)中：Xi——样品中各伏马毒素残留含量，单位为mg\...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞明正，王淑芳，孙月，董飞，徐剑宏，史建荣，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32