一种检测大肠杆菌的电化学生物传感器的制备方法技术

本发明专利技术属于电化学生物检测领域，解决了大肠杆菌特异性检测的电化学传感器的制备问题。要点如下：首先该电化学传感器以玻碳电极为基底电极，将制备的氧化石墨烯滴加在玻碳电极表面，在PBS缓冲液中进行循环伏安扫描，完成氧化石墨烯的电还原，之后将电极浸泡在氯金酸溶液中，通过电化学还原在玻碳电极的表面覆盖一层金纳米薄膜，然后，利用探针DNA的端氨基与金纳米粒子之间的金氨共价键和静电吸附作用，将探针DNA固定在电极表面，完成传感器的制备。实验表明，这两种修饰材料极大的增加了电子在电极表面的传输速率，同时增大电极的电活化面积，保证了传感器的灵敏度及检测限，因此它在食品、医药、环境等领域将有巨大的应用潜力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于电化学生物检测领域，特别涉及了一种新型高灵敏度与检测限的大肠杆菌特异性检测的电化学传感器的制备问题。
技术介绍
石墨烯(graphene)是碳原子以sp2杂化方式连接成的二维晶体，由正六边形的晶格组成，每个碳原子通过σ键与其他三个碳原子相连，这些较强的C-C键使得石墨烯具有优良的刚性结构。每个碳原子中未成键的π电子在与平面垂直的方向上形成大的π轨道且π电子可以在晶体中自由移动，这便使得石墨烯具有良好的导电性。因此常用作电化学电极的修饰材料。电化学DNA传感器在DNA检测中具有重要的位置，随着科技的进步电化学DNA传感器向着高精准、高选择性、低成本和小型化等方向发展。在电化学DNA传感器的制作过程中，基于DNA的直接氧化反应的方法是最为经济简便的。石墨烯和纳米金修饰的电极可以对DNA中的四种碱基(腺嘌呤A、胞嘧啶C、鸟嘌呤G和胸腺嘧啶T)进行同时测定并且互不干扰。此外基于DNA与石墨烯或GO的π-π电子的相互作用、静电作用以及疏水作用也可构建电化学DNA传感器。因此，电化学法可以对大肠杆菌进行快速、准确诊断的分析检测。
技术实现思路
本实验中设计了一种操作简单，检测快速、准确的电化学DNA传感器，并且实现了对大肠杆菌目标DNA的检测。本专利技术的主要内容包括：(1)氧化石墨烯的制备及电化学还原本实验采用改进的Hummers，成功合成了高质量的氧化石墨烯.称取制备完成的氧化石墨烯粉末2.0g溶解于1ml超纯水中，配制成2.0g/ml的溶液，然后于超声清洗机中进行超声剥离60min，得到深棕色悬浊液。将制备完成的氧化石墨烯溶液滴加在经过打磨并超声清洗过的玻碳电极表面，并且在在PBS缓冲液中进行循环伏安扫描，完成氧化石墨烯的电还原。(2)AuNPs的电沉积将ERGO修饰的玻碳电极用蒸馏水冲洗后放置氯金酸溶液中。采用电化学方法沉积300s，可以在电极表面形成一层致密的金膜，电沉积完成后，立即将电极取出用蒸馏水冲洗，最后用氮气吹干，即完成AuNPs的电沉积。具体实施方式实施例1(1)氧化石墨烯的制备及电化学还原在冰水浴条件下，取浓硫酸60mL加入到盛有2.0g石墨粉和2.0g硝酸钠的三口烧瓶中，保证烧瓶内温度维持在4℃左右。然后将研磨后的12.0g高锰酸钾加入其中，将体系加热到35℃，保持90分钟，以2滴每秒的速度加入80mL二次水。然后将混合物加热到95℃冷凝回流，保持1.5小时。反应结束后向其中加入超纯水200mL，待溶液温度自然降温至50℃后加入10mL30％的过氧化氢，反应完成得到亮黄色悬浊液。经离心清洗、透析去除产物中未反应完全的杂质及金属离子，并将产物pH值调至7左右。真空干燥后研磨得到产物氧化石墨烯粉末。称取制备完成的氧化石墨烯粉末2.0g溶解于1ml超纯水中，配制成2.0g/ml的溶液，然后于超声清洗机中进行超声剥离60min，得到深棕色悬浊液。用移液枪取15μL滴加在预处理完成的玻碳电极表面，电极垂直倒置，室温中自然晾干。之后用蒸馏水缓缓冲洗后放置在0.1M PBS缓冲液中进行循环伏安扫描(扫描范-1.7V--0V，扫速50mV/s)，至峰形及峰电流值稳定不变为止，完成氧化石墨烯的电还原。(2)AuNPs的电沉积将ERGO修饰的玻碳电极用蒸馏水冲洗后放置在5.0mM的氯金酸溶液中，氯金酸溶液以0.5M的硫酸溶液为溶剂配制。在-0.4V的电压下电沉积300s，可以在电极表面形成一层致密的金膜，电沉积完成后，立即将电极取出用蒸馏水冲洗2min，以防止金纳米粒子在电极表面的进一步增长。最后用氮气吹干，放置备用。(3)电化学传感器的构建①本实验采用改进的Hummers，成功合成了高质量的氧化石墨烯.称取制备完成的氧化石墨烯粉末2.0g溶解于1ml超纯水中，配制成2.0g/ml的溶液，然后于超声清洗机中进行超声剥离60min，得到深棕色悬浊液。②将经步骤①制备完成的氧化石墨烯溶液滴加在经过打磨并超声清洗过的玻碳电极表面，并且在在PBS缓冲液中进行循环伏安扫描，完成氧化石墨烯的电还原。③将步骤②所制备的被ERGO修饰的玻碳电极用蒸馏水冲洗后放置在5.0mM的氯金酸溶液，在-0.4V电势下电沉积300s，会在电极表面形成一层光亮的金膜。④将经步骤③氧化还原后的电极用蒸馏水冲洗2min，以防止金纳米粒子在电极表面的进一步增长，并用氮气吹干，放置备用。⑤在经步骤④处理的电极表面滴加5μL端氨基修饰的探针DNA(10μM)和10μL Tris-HCl缓冲完成电极的修饰。然后用Tris-HCl缓冲液(含20mM的NaCl溶液)和超纯水缓缓清洗，去除未结合的探针DNA和杂质，最后用氮气吹干备用，完成传感器的制备。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于石墨烯和金纳米粒子修饰的玻碳电极，其特征在于显著增强了玻碳电极的电化学性能。

【技术特征摘要】
1.一种基于石墨烯和金纳米粒子修饰的玻碳电极，其特征在于显著增强了玻碳电极的电化学性能。2.一种检测大肠杆菌的电化学传感器，其特征在于实现了大肠杆菌的快速、灵敏的检测。3.权利要求1所述的基于石墨烯和金纳米粒子修饰的玻碳电极，其制备方法为：(1)ERGO修饰玻碳电极称取制备完成的氧化石墨烯粉末2.0g溶解于1ml超纯水中，配制成2.0g/ml的溶液，然后于超声清洗机中进行超声剥离60min，得到深棕色悬浊液，用移液枪取15μL滴加在预处理完成的玻碳电极表面，电极垂直倒置，室温中自然晾干，之后用蒸馏水缓缓冲洗后放置在0.1MPBS缓冲液中进行循环伏安扫描(扫描范围-1.7V--0V，扫速50mV/s)，至峰形及峰电流值稳定不变为止，完成氧化石墨烯的电还原，至此，得到ERGO修饰的玻碳电极。(2)AuNPs的电沉积将ERGO修饰的玻碳电极用蒸馏水冲洗后放置在5.0mM的氯金酸溶液中，氯金酸溶液以0.5M的硫酸溶液为溶剂配制，在-0.4V的电压下电沉积300s，可以在电极表面形成一层致密的金膜，电沉积完成后，立即将电极取出用蒸馏水冲洗2min，以防止金纳米粒子在电极表面的进一步增长，最后用氮气吹干，放置备用。4.权利要求2所述的一种检测大肠杆菌的电化学传感器，其制备方法为：(1)本实验采用改进的Hummers，成功合成了...

【专利技术属性】
技术研发人员：许世超，温俊男，张忆一，
申请(专利权)人：天津工业大学，
类型：发明
国别省市：天津;12