一种鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的分子方法技术

本发明专利技术提供鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的方法，包括如下步骤：1)提取待鉴定样品的DNA；2)以步骤1)提取的DNA为模板，使用上述引物对进行PCR扩增，并纯化扩增产物；3)对步骤2)的纯化后的PCR扩增产物进行测序，通过碱基变异位点、遗传距离、系统发育树对两个种进行准确区分。本发明专利技术提供了通过分子生物学鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的方法，操作简单，鉴定准确，可广泛推广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子标记
，特别是涉及一种鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的分 子方法。
技术介绍
格母管蓟马（Gynaikothripsficorum)与格管蓟马（Gynaikothripsuzeli)均属 于缕翅目（作78&11(^七6瓜）管蓟马科(？]11&6〇1：]11'丨。丨(1&6)母管蓟马属(67仙丨1<：〇1：]11'丨。8)，是我 国热带和亚热带地区榕树上的重要经济害虫。两种蓟马锉吸危害榕树新梢及嫩叶，初期导 致叶片卷曲形成"饺子"状或"疙瘩"状虫癭，整个虫体藏匿于其中栖息、生活与繁殖，后期叶 片逐渐出现变硬及枯死症状，危害严重时会导致整株叶片变黄枯死脱落，特别是盆景榕树 受害后，无论观赏价值还是经济价值都大大降低。此外，近年来，随着榕树苗木、盆景在不同 地区间的调运，两种蓟马已经传播至我国东北的黑龙江、辽宁，西北的内蒙古及华北地区的 河南、河北和山东地区的温室内及园林景区。综上所述，尽快找到一种快速准确鉴定这两个 种的方法从而采用合理的方法对它们进行防治就显得尤为重要。然而，大量蓟马方面的分 类专家发现，榕母管蓟马和榕管蓟马无论体型、体色还是其它鉴定特征方面都非常相似，即 使是专业技术人员也常常将它们弄混淆。由于这两种蓟马个体较小并且非常相似，仅通过 形态特征对这两个种进行鉴别非常困难。 随着DNA分子标记技术的发展和成熟，DNA条形码技术在物种鉴定中的应用越来越 广泛，为我们提供了一种经济、简单、快捷并且准确的物种鉴定方法。DNA条形码技术在鸟 类，鱼类中的应用已有大量的研究报道，然而在缨翅目昆虫中的报道相对较少，仅有关于田 间蓟马种类鉴定的报道，而关于榕树上的主要害虫一管蓟马鉴定方面未见有报道。因此，本 专利技术的目的是通过标准DNA条形码分子标记，实现榕母管蓟马和榕管蓟马快速准确鉴别。
技术实现思路
为了解决传统形态学很难准确鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的问题，本专利技术提供一 种鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的分子方法。专利技术人利用DNA条形码通用型引物对提取的榕母管蓟马和榕管蓟马线粒体DNA细 胞色素C氧化酉每亚基I(mitochondrialcytochromecoxidasesubunitIgene,mtDNA C0I)基因（646bp)或核糖体DNA第二内部转录间隔区（internaltranscribedspacer2, ITS2)分子标记进行PCR扩增及双向测序，并对序列进行拼接比对、数据处理，采用邻接法 (NJ法)构建系统发育树，并以K2P(Kimuratwo-parameter)模型计算种内种间遗传距离，鉴 别开了榕母管蓟马和榕管蓟马。本专利技术提供的，包括如下步骤： 1)提取待鉴定样品的总基因组DNA; 2)以步骤1)提取的DNA为模板，使用引物对进行PCR扩增，并纯化PCR扩增产物； 3)对步骤2)的纯化后的PCR扩增产物进行测序，依据特定位点的测序结果判断样 品为榕母管蓟马还是榕管蓟马。 其中，所述引物对为C0I基因引物对和/或ITS2分子标记引物对。 所述C0I基因引物对如下： 上游引物:5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'，核苷酸序列如SEQIDN0·l所示； 下游引物：5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'，核苷酸序列如SEQIDN0.2所 不。 所述ITS2分子标记引物对如下： 上游引物：5'-AGACTCCTTGGTCCGTGTTTC-3'，核苷酸序列如SEQIDN0.3所示； 下游引物:5'-ATCACTCGGCTCGTGGATCG-3'，核苷酸序列如SEQIDN0·4所示。 当使用⑶I基因引物对时，依据扩增产物的第28、78、82、88、92、97、103、151、166、 172、214、235、265、271、328、337、347、355、364、370、445、457、470、472、503、525、538、610、 616、619、622bp处碱基进行判断： 如上述位点的碱基依次为G、C、G/T、A、A/T、C、G、T、G、C、G、T、A、C、G、A、T、T、A、A、A、 ? {、(^{，/^{、△、△{、了的则为榕母管蓟马； 如上述位点的碱基依次为A、T、G、G、A、T、A、C、A、T、A、C、G、T、A、G、C、C、G、G、A、T、A、 T、T、T、A、G、G、A、C的则为榕管蓟马。 当使用ITS2分子标记引物对时，依据扩增产物的第54、61、135、136、179、344、348、 374、376、377、378、606、633、661、662、709、790、841、906、966、978、979、1116、1144、1217、 1226、1227、1228、1250、1255、1258、1259、1325、1327、1331、1332bp处碱基进行判断： 如上述位点的碱基依次为C、C、C/T、G、T、T/C、T、A、T、T、T、A、A、T、T、A/G、G/A、T、C/ T、T、G、A、T、T/C、A、A、A、G、T、T、T、C、G、A/G、A、C的为榕母管蓟马； 如上述位点的碱基依次为T、C/T、T、A、T/C、C、C、C/T/A、C/T、A/T、G/T、G、G、A、A、A/ 6、八、厶、(：、17^、1'^/(：、了/(：、1'、6、6^/6、(：/^、(：、(：、(：、1'^^、6/^、(：/1'的为榕管蓟马。其中，步骤1)所述提取待鉴定样品的总基因组DNA，具体步骤如下：①挑取待测样品单头的成虫，去除腹部后其余组织置于离心管中加入液氮研磨至 匀浆状态，加入200yLGA缓冲液；②加入20~40yL蛋白酶K溶液； ③56°C震荡2~4h直至组织完全溶解；④加入200yL缓冲液GB，70°C震荡lOmin，离心使离心管壁的水珠沉入离心管底部； ⑤加入200yL无水乙醇，震荡混匀，离心以除去离心管盖内壁的水珠；⑥将⑤所得溶液及沉淀加入吸附柱CB3中，12000rpm离心lmin，倒掉废液，将吸附 柱CB3放回收集管中； ⑦向吸附柱CB3中加入500yL缓冲液GD，12000rpm离心lmin，倒掉废液，将吸附柱 CB3放回收集管中； ⑧向吸附柱CB3中加入700yL漂洗液PW，12000rpm离心lmin，倒掉废液，将吸附柱 CB3放回收集管中；再次重复该步骤；⑨将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心3min，倒掉废液，将吸附柱CB3开盖置 于无菌条件下室温放置20~30min，彻底晾干残存的漂洗液及无水乙醇；⑩将吸附柱CB3转入离心管中，向吸附膜的中间部位滴加70~200yL洗脱液TE或无 菌水，室温放置2~5min，12000rpm离心3min，收集DNA，将上清液再次加入吸附柱CB3中，室 温放置2min，12000rpm离心2min，再次收集DNA，收集的DNA置于-20°C保存。其中，步骤2)所述PCR的反应体系为25μ1体系：其中，步骤2)所述PCR的反应条件为94°C预变性3min，随后进行35个循环； 每个循环包括:94°C变性lmin，57°C退火lmin、72°C延伸lmin10s，末次循环72°C 延伸5min本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的分子方法，其特征在于，包括如下步骤：1)提取待鉴定样品的总基因组DNA；2)以步骤1)提取的DNA为模板，使用引物对进行PCR扩增，并纯化PCR扩增产物；3)对步骤2)的纯化后的PCR扩增产物进行测序，依据特定位点的测序结果判断样品为榕母管蓟马还是榕管蓟马。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张利娟，崔金杰，彩万志，张帅，雒珺瑜，王春义，吕丽敏，李春花，朱香镇，王丽，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：河南;41