促进转烟草促早花基因NtFT5烟草生根的培养基及获得短周期烟草的方法技术

本发明专利技术公开了促进转烟草促早花基因NtFT5烟草生根的培养基及获得短周期烟草的方法，其生根培养基为含0.1mg/L的NAA、pH为5.6～5.8的1/2MS固体培养基，该培养基能够促进转烟草促早花基因NtFT5的烟草生根，生根后能够正常的开花结籽，并将促早花性状通过种子遗传至下一代，播种后成功获得稳定遗传的短周期烟草后代，且烟草的生命周期缩短至2.5个月，能够满足基因功能鉴定及烟草育种研究的需要，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
促进转烟草促早花基因NtFT5烟草生根的培养基及获得短周期烟草的方法
本专利技术属于植物组织培养
，涉及促进转烟草促早花基因NtFT5烟草生根的培养基，还涉及利用该培养基获得周期烟草的方法。
技术介绍
开花是作物生产中的一个重要的农艺性状，其受自主信号途径、光周期、春化途径及植物激素赤霉素等信号途径综合影响。在拟南芥中，这些信号途径均通过磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族phosphatidylethanolamine-bindingprotein(PEBP)family成员发挥调控作用。在众多植物中，PEBP家族成员之间已进化为相互拮抗的三个亚家族，它们是FLOWERINGLOCUST(FT)、TERMINALFLOWER1(TFL1)和MOTHEROFFTANDTFL1(MFT)。FT和MFT成员被认为主要是促进开花的亚家族。拟南芥中过表达FT成员FT、TSF和MFT成员均能促进拟南芥早花。烟草作为一种模式生物，它具有最简单的生长习性和最可靠的转化过程。以烟草作为模式植物，研究次级代谢产物生物合成途径、植物与细菌互作、植物与病虫害互作、维管组织的形成以及花发育过程和花色均具有显著优势并已形成了研究特色。在众多植物中，许多关于功能基因鉴定和顺式作用因子的基因组研究均以烟草为受体植物。然而，烟草生育周期长已经成为烟草品种培育的主要限制因素。研究发现，拟南芥FT基因能缩短开花时间，还发现烟草NtFT4，NtFT5也能促进烟草早花，但是现有条件下，此基因转化后植株尽管能在培养基上早花，但是花朵通常很快凋零，不能形成种子，不能生根，不能获得稳定遗传的短周期烟草苗。因此，急需一种能够获得稳定遗传的、短周期转基因烟草苗的方法，且获得的转基因烟草缩短开花时间，能够生根并形成种子。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供促进转烟草促早花基因NtFT5烟草生根的培养基；本专利技术的目的之二在于提供利用所述培养基获得稳定遗传的、短周期烟草的方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：1、促进转烟草促早花基因NtFT5烟草生根的培养基，所述生根培养基为含0.1mg/L的NAA、pH为5.6～5.8的1/2MS固体培养基，所述1/2MS为大量元素减半的MS培养基。优选的，所述生根培养基为1/2MS+0.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，调节pH至5.8。2、利用所述培养基获得短周期烟草的方法，包括如下步骤：A.以SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示序列为引物，烟草cDNA为模板进行PCR扩增，获得烟草促早花基因NtFT5，将扩增获得的烟草促早花基因NtFT5连入pCXSN载体XcmI酶切位点处，得NtFT5-pCXSN重组质粒；将所得NtFT5-pCXSN重组质粒转化农杆菌，得含有NtFT5-pCXSN重组质粒的工程菌；B.将步骤A所得工程菌采用叶盘法转化烟草，在含1mg/L6-BA，0.1mg/LNAA30g/L蔗糖，8g/L琼脂，pH为5.8的MS培养基上共培养3天，然后在1mg/L6-BA，0.1mg/LNAA，250mg/L羧苄青霉素，20mg/L潮霉素，30g/L蔗糖，8g/L琼脂，pH为5.8的MS培养基上诱导抗性苗，然后利用PCR筛选含有潮霉素基因的植株，得T0代转NtFT5基因烟草；C.将步骤B所得T0代转NtFT5基因烟草在所述的培养基上生根培养，生根后移栽至培养基质中培养至开花、结籽，将获得的种子萌发后获得短周期烟草。优选的，步骤A中，所述PCR扩增的条件为95℃预变性3min；94℃变性30s，54.0℃退火45s，72℃延伸40s，循环35次；最后72℃后延伸10min。优选的，步骤A中，所述农杆菌为LBA4404。本专利技术的有益效果在于：本专利技术针对烟草转促早花基因FLOWERINGLOCUST(FT)后，难以生根结子、无法获得稳定遗传的短周期烟苗后代的情况，在生根培养基及培养方法上进行了系统研究和优化，所得培养基生根率高，试管苗移栽成活率高，能产生可育性种子，成功获得稳定遗传的短周期烟苗后代，转NtFT5基因烟苗的生命周期缩短至2.5个月，能够满足基因功能鉴定及烟草育种研究的需要，具有良好的应用前景。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图：图1为NtFT5-pCXSN重组质粒示意图。图2为转NtFT5基因烟草抗性苗。图3为转NtFT5基因烟草在D3培养基中培养后生根情况。图4转NtFT5基因烟草生根后移栽至泥炭栽培基质(品氏)中成功开花。图5为NtFT5基因烟草T1代长势良好。具体实施方式下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、烟草促早花基因(FLOWERINGLOCUST)NtFT5转基因载体构建根据在Genbank烟草GSS数据库中(FH969747.1)序列设计扩增烟草NtFT5基因编码区的引物，上游引物NtFT5-F为：5’-atgccaagagaacgtgaacc-3’(SEQIDNO.1)；下游引物NtFT5-R为：5’-tcaatcggcagaccttctac-3’(SEQIDNO.2)；然后以烟草叶片cDNA为模板，以SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示序列为引物，进行PCR扩增。PCR扩增体系为25μL，各组分体积如下：cDNA1.0μL，NtFT5-F1.0μL，NtFT5-R1.0μL，GreenMasterMix酶12.5μL，ddH2O9.5μL，然后按如下程序进行PCR扩增：95℃预变性3min；94℃变性30s，54.0℃退火45s，72℃延伸40s，循环35次；72℃延伸10min。将PCR扩增产物按照Transgen公司的EasyPureQuickGelExtractionKit说明书进行回收并纯化，获得纯化后的NtFT5扩增产物。将pCXSN载体(pCXSN载体公开于Chen,S.,etal.,AversatilezerobackgroundT-vectorsystemforgenecloningandfunctionalgenomics.PlantPhysiol,2009.150(3):p.1111-1121.质粒含自杀基因ccdB，经XcmI酶切产生末端T，可与带A末端的目的基因通过TA克隆策略，获得含有目的基因的过表达载体)用NEB公司的XcmI进行酶切，酶切体系如下：pCXSN质粒1.4μg，XcmI1.0μL，NEBbuffer25.0μL，ddH2O加至50μL，然后在37℃条件下酶切3小时。酶切后将pCXSN载体线性片段进行回收，然后与回收的纯化的NtFT5扩增产物按摩尔比为6:1～7:1连接，连接体系如下：连接条件：25℃条件下连接3小时。将连接产物加入-80℃取出刚融化的DH5α感受态，冰浴30min，然后42℃热激45s，冰浴2min后加入300μLLB培养基，于37℃200rpm摇床培养1小时；培养后将菌液离心后弃上清，将菌体涂至含50mg/LKan的LB抗性平板上，于37℃恒温箱倒置培养过夜。次日，本文档来自技高网...

【技术保护点】
促进转烟草促早花基因NtFT5烟草生根的培养基，其特征在于：所述生根培养基为含0.1mg/L的NAA、pH为5.6～5.8的1/2MS固体培养基，所述1/2MS为大量元素减半的MS培养基。

【技术特征摘要】
1.促进转烟草促早花基因NtFT5烟草的生根培养基在诱导转烟草促早花基因NtFT5烟草生根中的应用，其特征在于：所述生根培养基为含0.1mg/L的NAA、pH为5.6~5.8的1/2MS固体培养基，所述1/2MS为大量元素减半的MS培养基。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述生根培养基为1/2MS+0.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，调节pH至5.8。3.利用促进转烟草促早花基因NtFT5烟草的生根培养基获得短周期烟草的方法，其特征在于，包括如下步骤：A.以SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示序列为引物，烟草cDNA为模板进行PCR扩增，获得烟草促早花基因NtFT5，将扩增获得的烟草促早花基因NtFT5连入pCXSN载体Xcm酶切位点处，得NtFT5-pCXSN重组质粒；将所得NtFT5-pCXSN重组质粒转化农杆菌，得含有NtFT5-pCXSN重组质粒的工程菌；B.将步骤A所得工程菌采用叶盘法转化烟草，在含1mg/L6-B...

【专利技术属性】
技术研发人员：王根洪，夏庆友，王佩，高军平，熊海军，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;85